生物技術(shù)在園林中的應(yīng)用

生物技術(shù)在園林植物的應(yīng)用摘要：隨著人類經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生物賴以生存的環(huán)境發(fā)生了巨大的變化。熱島效應(yīng)、溫室效應(yīng)、環(huán)境污染、土壤的鹽堿化和耕地的荒漠化等現(xiàn)象對(duì)農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)植物和植被植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了嚴(yán)重的逆境脅迫作用。其中氣候的變化是妨礙植物生長(zhǎng)的一個(gè)重要的限制因子，突發(fā)的低溫冷害和凍害嚴(yán)重妨礙許多經(jīng)濟(jì)植物尤其是熱帶型植物的生長(zhǎng)。用生物工程技術(shù)開發(fā)抗逆的植物種質(zhì)新材料不僅具有十分重要的社會(huì)意義，而且已經(jīng)成為當(dāng)代生物工程研究和植物改良領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。微觀的技術(shù)手段和宏觀的生態(tài)學(xué)原理相結(jié)合正在成為研究的新領(lǐng)域。通過(guò)生物工程技術(shù)包括分子克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物材料的抗逆性遺傳特性，力圖探索其基因表達(dá)調(diào)控途徑的機(jī)理，改善其抵抗低溫脅迫的能力，緩解城市脅迫對(duì)植物分布、生長(zhǎng)發(fā)育和經(jīng)濟(jì)效益等帶來(lái)的不利影響，改善生態(tài)環(huán)境。關(guān)鍵詞：生物技術(shù)園林植物抗冷脅迫低溫轉(zhuǎn)基因技術(shù)近年來(lái)，生物技術(shù)育種作為一種高新技術(shù)育種方式日益達(dá)到重視，隨著我國(guó)園林綠化市場(chǎng)的不斷發(fā)展，園林植物育種也逐步走向高新技術(shù)領(lǐng)域，在傳統(tǒng)育種技術(shù)的基礎(chǔ)上，融入了現(xiàn)代生物技術(shù)育種。使園林植物在生產(chǎn)規(guī)模以及性狀改良方面得到了前所未有的發(fā)展。1園林植物組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀植物組織培養(yǎng)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)觀賞植物規(guī)?；?、現(xiàn)代化生產(chǎn)的重要途徑.快速繁殖技術(shù)和脫毒苗培育技術(shù)是植物組織培養(yǎng)應(yīng)用最廣泛和最有成效的2個(gè)領(lǐng)域。其中細(xì)胞工程技術(shù)在園林植物育種領(lǐng)域發(fā)展迅速。主要針對(duì)具有優(yōu)良遺傳基礎(chǔ)的園林植物及脫毒種苗的迅速繁殖。近年來(lái)，通過(guò)細(xì)胞工程技術(shù)已培育出一批新種質(zhì)。如南京林業(yè)大學(xué)開展了桑、楊樹、懸鈴木等樹種原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合技術(shù)研究；中科院遺傳所、植物所、植物生理所、全國(guó)大部分農(nóng)、林科學(xué)研究院和高等院校、園藝和園林科研院所大多涉及園林植物組織培養(yǎng)、快繁和脫毒等領(lǐng)域的研究,并取得了可喜的成績(jī)。有報(bào)道的有大花惠蘭、新幾內(nèi)亞鳳仙、虎刺梅、彩葉丁香、月季、菊花、蘭花、香石竹、金魚草、大麗花、瓊花、萱草、矮牽牛、榆葉梅、海棠、非洲紫羅蘭、唐菖蒲、郁金香、馬蹄蓮、大巖桐、仙客來(lái)、玉簪、豆瓣綠、綠巨人、楓香、鵝掌楸、火鶴、鳳梨、鐵線蕨、竹子（以叢生竹為主）等上百種園林植物，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)研究，建立起了優(yōu)良種苗快繁生產(chǎn)技術(shù)體系；北京園科所、北京農(nóng)大等培育出菊花、上海園科所、中國(guó)農(nóng)科院花卉所培育出的香石竹、沈陽(yáng)園科所培育出的唐菖蒲等園林植物的脫毒苗，為生產(chǎn)提供了優(yōu)質(zhì)種苗。2與園林植物相關(guān)的基因克隆2.1與開花有關(guān)的基因開花基因首先由英國(guó)諾里奇的Enrico.coen博士和Rosemary.capenter領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從金魚草分離出來(lái)，這種基因經(jīng)突變失活后，植物便不能開花，而是不斷地產(chǎn)生葉芽，該基因的鑒定為人們了解如何控制植物的發(fā)育提供了證據(jù)。美國(guó)和日本科學(xué)家還克隆出對(duì)花特異表達(dá)的莽草酸合成酶基因表達(dá)起誘導(dǎo)作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子EPF1,可以改變花色花形，對(duì)開花進(jìn)行調(diào)節(jié)。Kelly等從大煙草中克隆了NFL1和NFL2基因，其作用是特異地決定花和葉的前體細(xì)胞。在對(duì)擬南芥和金魚草的研究中發(fā)現(xiàn)了4對(duì)對(duì)花發(fā)育后期作用的基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因改變這些基因的結(jié)構(gòu)，可以控制植物開花和花形?，F(xiàn)已經(jīng)克隆出的大量與花發(fā)育有關(guān)的基因（TEL，CEN，EMF，F(xiàn)CA，AP1，AP2，AG等基因）為花型改造提供了新途徑。2.2與花香有關(guān)的基因產(chǎn)生花香的物質(zhì)通常有萜類、醇類等，但由于它們的結(jié)構(gòu)和合成過(guò)程復(fù)雜，在花香基因調(diào)控方面研究進(jìn)展緩慢。1994年法國(guó)人利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化檸檬天竺葵，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株的芳香物含量比對(duì)照株多2?4.4倍，從而為這一基因工程提供了一條途徑。2.3與花色有關(guān)的基因克隆與花色有關(guān)的基因工程研究很多，獲得的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也最多。目前克隆的控制花的顏色的基因主要是一些影響花色素苷代謝的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，主要是從矮牽牛、玉米和金魚草等植物中分離并克隆出來(lái)。主要有CHS，XHI，F(xiàn)3H，DFR，ANS，3GT，GHSA。另外還以已有的基因?yàn)樘结?，用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)分離一些植物花色素苷調(diào)節(jié)基因，主要有R，S，Sn，LS，B，CI，PL，VpL，Del,TED,3,DEF。山茶花轉(zhuǎn)入了影響花色的基因，使花的顏色產(chǎn)。生了變化，得到黃色的山茶花。目前利用轉(zhuǎn)基因方法獲得的改變花色的花卉品種有矮牽牛,非洲菊,康乃馨、玫瑰、蝴蝶草、高原龍膽，百合等。2.4延緩花卉衰老的基因工程現(xiàn)在，觀賞花卉上延緩衰老的基因工程研究十分活躍，大部分的轉(zhuǎn)基因操作主要集中在觀賞價(jià)值和商品價(jià)值很高的模式植物香石竹上。FlorigeneAustralia公司將ACC合成酶基因反向?qū)胂闶?，轉(zhuǎn)基因的香石竹比正常香石竹延長(zhǎng)了2倍的觀賞壽命。由于乙烯的濃度是決定切花保鮮期的重要因素。因此控制切花在儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中的乙烯合成對(duì)于延長(zhǎng)保鮮期，提高切花品質(zhì)至關(guān)重要。近幾年來(lái)，對(duì)控制乙烯合成的基因和衰老過(guò)程中基因的表達(dá)進(jìn)行了深入研究，目前所克隆的基因主要有從番茄、蘋果、康乃馨中分離出的Acc合成酶與氧化酶基因，PG基因，NR基因等。這些基因多數(shù)通過(guò)反義RNA法,反向克隆于受體基因組中，從而達(dá)到抑制植物體內(nèi)內(nèi)源乙烯及其合成前體的形成，減緩衰老，使花期得以延長(zhǎng)。已獲得的轉(zhuǎn)基因花卉有矮牽牛，康乃馨，滿天星等。2.5抗病蟲基因工程研究在抗細(xì)菌病害方面主要有從矮牽牛中分離出的CHSA基因，對(duì)于由真菌所引發(fā)的病害，主要利用幾丁質(zhì)酶基因來(lái)轉(zhuǎn)化植株。對(duì)于由病毒引起的病害,應(yīng)用較多的是利用病毒殼蛋白基因和病毒衛(wèi)星RNA來(lái)轉(zhuǎn)化植株。用此法育出的抗病植物有唐菖蒲等。另外，在接骨木、刺槐和國(guó)槐的韌皮部也發(fā)現(xiàn)了外源凝集素的積累，吉田等1992年從刺槐中克隆出了外源凝集素的cDNA，并測(cè)定了其堿基序列。從矮牽牛中分離出的CHSA基因，轉(zhuǎn)入楊樹，可提高楊樹的抗病能力，證明類黃酮合成酶基因具有抗病作用。在抗蟲方面，1989年P(guān)arsons等從楊樹中克隆出了損傷激活基因的cDNA,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序得知其表達(dá)產(chǎn)物之一是類似大豆胰蛋白酶抑制多肽，它能干擾昆蟲消化功能，從而達(dá)到抑蟲作用。1993年英國(guó)科學(xué)家從雪花蓮中克隆出了雪花蓮凝集素(GNA)基因，它對(duì)稻飛虱、葉蟬、蚜蟲等害蟲有毒性作用。現(xiàn)在GNA基因作為抗蟲基因在其它作物上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外，在蔬菜上被廣泛應(yīng)用的Bt基因也被引入花卉的抗蟲育種中，在實(shí)際生產(chǎn)上起到了較好的效果。如育出的抗蟲菊花。2.6其它抗性基因及品質(zhì)基因其它抗性基因的研究主要是抗寒和抗旱方面的研究。僅有一些理論技術(shù)工參考。Wada等從從抗寒的藍(lán)綠藻中克隆了與脂肪酸不飽和度有關(guān)的基因DesA,并導(dǎo)耐寒的藍(lán)綠藻，增強(qiáng)了抗寒能力。Murata等通過(guò)導(dǎo)入擬南芥葉綠體的甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，使煙草抗寒性增加。黃永芬等將每周擬蝶抗蛋白基因?qū)敕阎?，其抗寒性提高，如果將這些基因到土不耐寒的花卉中，就能夠培育出理想的耐寒品種。另外，抗除草劑的基因轉(zhuǎn)化工作也取得了一定的進(jìn)展，目前已育出抗除草劑的金魚草。三、植物的抗逆性逆境及植物的抗逆性通常人們將植物的各種環(huán)境脅迫叫做逆境(Lessfavorableenvironments)，植物對(duì)這種逆境脅迫(Stress)有一種內(nèi)在的抗性叫抗逆性(Stressresistance)(Grover,A“al.，2001)。張正斌認(rèn)為:植物的整體抗逆性是指植物在整個(gè)生命過(guò)程中(包括生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)種子收獲儲(chǔ)藏休眠期)，具有的由基因控制的、能夠抵抗各種外來(lái)環(huán)境脅迫的能力，使生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、生活力受到有限的危害水平，它可反映在分子、細(xì)胞、組織器官、個(gè)體植株、群體甚至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的不同水平上。植物的抗逆性來(lái)自兩個(gè)方面，一是通過(guò)自然選擇即適應(yīng)獲得的;二是人工選擇培育，通過(guò)誘變篩選、雜交育種、基因工程等方法，進(jìn)行植物抗逆性的改良；另外還可通過(guò)人工保護(hù)和調(diào)控措施，增強(qiáng)植物抗逆性。植物育種的抗逆性改良由來(lái)已久，貢獻(xiàn)巨大，野生植物所具有的珍貴特殊抗性，對(duì)改良栽培植物的抗逆性具有重要意義。傳統(tǒng)的以有性雜交為主的植物品種常規(guī)改良途徑在上世紀(jì)有了巨大的發(fā)展，通過(guò)有性雜交獲得的同時(shí)具有兩個(gè)親本優(yōu)良性狀的子代可以具有更高的抗逆性和更優(yōu)良的品質(zhì)，但缺點(diǎn)是育種周期長(zhǎng)，育種資源的遺傳背景狹窄、難以克服性狀的負(fù)相關(guān)連鎖、雜種的有利抗逆性狀容易分離等。植物抗逆性一寒性抗寒性，在全球氣候變暖的大背景下，當(dāng)前氣候的一個(gè)顯著特點(diǎn)是四季的節(jié)律失調(diào)，氣候的不規(guī)則性增強(qiáng)。其中突發(fā)的低溫冷害和凍害嚴(yán)重妨礙許多經(jīng)濟(jì)植物尤其是熱帶型植物的生長(zhǎng)，全球每年因低溫冷害和凍害造成農(nóng)作物和園藝植物的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元，通過(guò)提高植物的抗寒性可以改變植物原有的地域分布，擴(kuò)大植物的地理分布區(qū)，提高熱帶經(jīng)濟(jì)植物的產(chǎn)量。調(diào)控植物抗逆性的途徑對(duì)于植物抗逆性調(diào)控機(jī)制主要有以下兩種途徑，一是通過(guò)傳統(tǒng)的遺傳育種對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，這方面的研究雖已有大量積累，但還有許多未知的領(lǐng)域，利用新的品種在新的逆境和新的栽培措施條件下產(chǎn)生抗性，這是一個(gè)必不可少和對(duì)高產(chǎn)獲得有現(xiàn)實(shí)意義的研究方面。二是通過(guò)生物工程技術(shù)對(duì)植物的代謝途徑和基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，即通過(guò)響應(yīng)?膜?酶?作用中心~代謝轉(zhuǎn)換機(jī)制和表現(xiàn)型一基因型?基因?DNA--RNA—酶一蛋白質(zhì)?結(jié)構(gòu)與功能的路徑，應(yīng)用生物工程技術(shù)對(duì)關(guān)鍵酶或關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆并使其表達(dá)來(lái)提高植物的整體抗逆性。是未來(lái)生理生化和分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要方向，也是當(dāng)前和未來(lái)基因克隆和轉(zhuǎn)基因中研究的關(guān)鍵問(wèn)題(張正斌，2000).四、植物抗冷脅迫的機(jī)理及意義植物對(duì)環(huán)境變遷及不良環(huán)境有足夠的適應(yīng)性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統(tǒng)進(jìn)化的遺傳基因型所控制，又受個(gè)體發(fā)育中的生理生態(tài)因素所制約。溫度作為重要的環(huán)境因子之一，限制植物的分布及生長(zhǎng)和產(chǎn)量(ViswanathanC,2002)，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著決定性作用。一些植物在長(zhǎng)期的系統(tǒng)進(jìn)化中產(chǎn)生了獨(dú)特的耐冷耐凍機(jī)制，如大量溫帶植物在冰點(diǎn)以上的低溫環(huán)境中能夠獲得對(duì)低溫的適應(yīng)性，變的更加抗凍，即發(fā)生了所謂的冷適應(yīng)(Levitt,1980)。但目前對(duì)植物這種冷適應(yīng)的機(jī)理還不十分清楚，因此探索植物抗寒性的遺傳機(jī)理并利用生物工程的手段改變植物的遺傳特性不僅在基礎(chǔ)理論上具有重要意義，在解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題上也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。植物的抗寒過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)和生理學(xué)的變化過(guò)程，它包括植物體糖含量的改變(Welinetal.，1995)，膜脂合成物的改變(Hajelaeta1.，1990)，可溶性蛋白(脯氨酸)和可混溶滲透物質(zhì)(甜菜堿，多經(jīng)基化合物)的聚集(Viswanathanetal.，2002),ABA的瞬時(shí)增加或減少或者植物生長(zhǎng)的停滯(Levitt,J.1980),荷爾蒙水平和基因表達(dá)的改變。(Guy,1990;linandThomashow,1992;PalvaET,1994;SakaiandLarcher,1987;Hughes,1996;Iba,2002簡(jiǎn)令成和吳素首(1965)報(bào)道，細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)的破壞是植物在低溫逆境中造成傷害和死亡的重要原因。（鄧江明，簡(jiǎn)令成2001）.五、抗凍蛋白AFP的發(fā)展抗凍蛋白是一類抑制冰品生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，包括不含糖基的AFPs和含糖基的AFGPs（antifreezeglycoproteins），具有三個(gè)基本特征：（尹明安等，2001）熱滯效應(yīng)（thermalhysteresisactivity,THA）、冰品形態(tài)效應(yīng)、重結(jié)品抑制效應(yīng)（recrystallizationinhibition,RI）。對(duì)3類生物的AFPs分析表明，其化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、空間構(gòu)型均不相同：同類生物之間的AFPs同源性也不高，幾乎不存在相似性序列或結(jié)構(gòu)模式，說(shuō)明它們可能是在不同的有機(jī)體中獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)，沒(méi)有共同的演化規(guī)律（盧存福等，1998;BarrettJ,2001;孫淑貞等，2002）。基于抗凍蛋白以上的種種特性，可以通過(guò)基因工程的手段，將抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入原來(lái)沒(méi)有抗凍蛋白的動(dòng)植物體內(nèi)，使其產(chǎn)生抗凍蛋白，從而提高其抗凍耐寒能力，可使原來(lái)不能在寒帶生長(zhǎng)的作物移植到寒冷地區(qū)栽培。植物內(nèi)源AFP基因更適合在植物體內(nèi)表達(dá)，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物在抗寒性改變上將會(huì)更明顯。六、植物冷誘導(dǎo)相關(guān)基因的發(fā)展己知植物在低溫鍛煉過(guò)程中，由于基因表達(dá)的改變，誘發(fā)合成許多新蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在抗寒中的作用大致可分為三類:1.行使酶的作用，改變植物的代謝途徑，使之進(jìn)入抗寒鍛煉;2.新合成的蛋白質(zhì)組入膜內(nèi)或附著于膜表面，對(duì)膜起穩(wěn)定作用:3.新合成的蛋白質(zhì)分布于液泡和細(xì)胞間隙中，起著阻止冰凍的作用，使細(xì)胞液在低溫卜處于過(guò)冷卻狀態(tài)。這類新蛋白質(zhì)多數(shù)為糖蛋白（簡(jiǎn)令成，1992）。近年來(lái)，分離和鑒定的抗凍基因，其表達(dá)產(chǎn)物一新合成的多膚，多數(shù)屬于第二類，它們具有高度的親水性，對(duì)膜起保護(hù)和穩(wěn)定作用，從而防止冰凍損傷，提高植物的抗凍性（鄧江明，簡(jiǎn)令成，2001）。耐寒基因是一種誘導(dǎo)基因，在特定條件（主要是低溫和短日照）下啟動(dòng)抗寒基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)展為抗寒力。隨著分子生物學(xué)技術(shù)幼發(fā)展和滲透，已經(jīng)能夠分離純化特異抗寒基因，分析氨基酸的序列并鑒定其功能并己證明抗寒性受幾個(gè)主效基因控制，并受一些修飾調(diào)節(jié)基因的作用，在植物體內(nèi)存在一系列抗凍基因表達(dá)途徑，形成基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)機(jī)制。當(dāng)遇到低溫冷害和凍害的時(shí)候，植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化變化。這些變化涉及到許多低溫反應(yīng)基因的表達(dá)與調(diào)控。七、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子克隆技術(shù)抗冷脅迫應(yīng)用及不足通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子克隆技術(shù)等生物工程技術(shù)手段對(duì)抗冷脅迫的基因表達(dá)調(diào)控途徑和機(jī)理進(jìn)行了研究，意在探索植物抗低溫脅迫的調(diào)控途徑和分子機(jī)制，為改造植物材料抗低溫脅迫的遺傳特性，提高其抵抗低溫脅迫的能力：改良由于溫度限制造成的綠化、觀賞植物材料品種單一，受地域或緯度限制等遺傳品質(zhì)并引進(jìn)和馴化或多種優(yōu)良的植物材料，緩解城市脅迫對(duì)植物分布、生長(zhǎng)發(fā)育和經(jīng)濟(jì)效益等帶來(lái)的不利影響，改善生態(tài)環(huán)境提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐操作平臺(tái)。在整個(gè)研究取得以上主要的結(jié)論和初步成果的同時(shí)，還有許多工作待完成和繼續(xù)深入的研究和探索。主要有以下幾方面：植物抗冷脅迫基因表達(dá)調(diào)控路徑需要更準(zhǔn)確的定位，并加以驗(yàn)證。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)抗冷脅迫的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的交錯(cuò)循環(huán)路徑所涉及的各調(diào)控因子的研究需要進(jìn)一步的進(jìn)行和完善，對(duì)于未知的可能存在的各調(diào)控路徑的支路、各種關(guān)鍵調(diào)控蛋白、關(guān)鍵酶和基因需要進(jìn)一步的探索并克隆和分離。需要對(duì)大量的不同的植物材料的抗冷脅迫途徑進(jìn)行研究，驗(yàn)證在植物中是否普遍存在抗冷脅迫的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，尤其是那些有代表性的本身具有抗凍、抗冷特性的植物。需要大量的與抗冷脅迫相關(guān)的基因、調(diào)控因子序列、數(shù)據(jù)的積累，及相應(yīng)的特征分析信息的積累，為進(jìn)一步研究抗冷脅迫基因表達(dá)調(diào)控完整的確切的途徑提供基礎(chǔ)研究。如在煙草這種模式植物中能夠成功的