DB15T 3037-2023 向日葵主要種傳病原真菌室內(nèi)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

發(fā)布發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局2023-06-112023-05-11Technicalcodeofpracticeforindoordetectionofmainspecies-bornepathogenicfungiinsunflowerseedsICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB16內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T3037—2023向日葵主要種傳病原真菌室內(nèi)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程IDB15/T3037—2023I前 言本文按GB/T1.1—2020《準(zhǔn)工導(dǎo)則 第部分標(biāo)化件結(jié)和起規(guī)》起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心。DB15/T3037—2023向日葵主要種傳病原真菌室內(nèi)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了向日葵種子攜帶真菌的室內(nèi)檢測(cè)和鑒定技術(shù)。本文件適用于室內(nèi)進(jìn)行向日葵種子帶黃萎病、枯萎病和黑斑病病原菌的檢測(cè)。本文件沒有規(guī)范性引用文件。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。用于檢測(cè)的向日葵種子來自市場(chǎng)上銷售的不同向日葵品種。每個(gè)向日葵品種隨機(jī)取100粒種子。每一個(gè)向日葵品種隨機(jī)選擇100粒飽滿的種子。將種子外殼剝?nèi)?，取出籽仁，將籽仁放入蒸溜水中浸?4h，用鑷子剝下種皮。種皮用70%乙醇浸泡1min，然后用無菌水漂洗兩次，每次1min。將種皮放置在滅菌的濾紙上晾干后，放在新鮮制備的MNP-10選擇性培養(yǎng)基（見附錄A）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃±2℃，每皿放置10個(gè)種皮。待種皮周圍出現(xiàn)菌落后，計(jì)數(shù)菌落的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)種子帶菌率。計(jì)算方式見公式（1）。X=（A/B）×100% （1）式中：X——種子帶菌率；A——帶菌的種子數(shù)；B——供試的種子總數(shù)。將菌落轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上后，利用稀釋梯度法進(jìn)行單孢純化。對(duì)純化后菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察并在顯微鏡下進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。向日葵黃萎病病、向日葵枯萎病及向日葵黑斑病病原菌特征見附錄B、附錄C、附錄D。12DB15/T3037—20232將在PDA平板培養(yǎng)基上擴(kuò)繁的真菌的菌落用蓋玻片刮下，轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，然后采用CTAB方法提取菌株的DNA，利用提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR鑒定，引物為ITS1和ITS4。引物信息：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’PCR程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取5.0μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，剩余的PCR產(chǎn)物用于測(cè)序分析。PCR產(chǎn)物測(cè)序后獲得的序列在Genbank進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果中同源性達(dá)到99%以上的就可以確定種皮上攜帶真菌的種名。3DB15/T3037—20233附錄A（資料性）MNP-10培養(yǎng)基配方（500ml）MNP-10培養(yǎng)基配方見表A.1。表A.1為MNP-10培養(yǎng)基配方配方組成滅菌方法Part1PGA5.0g，NaOH4.0g121℃，15minPart2KNO31.0g，KH2PO41.0g，KCL0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，Tergitol0.5ml，瓊脂粉15.0g121℃，15minPart3氯霉素25mg，鏈霉素25mg，金霉素25mg過濾滅菌4圖B.1大麗輪枝孢菌菌落、分生孢子梗和分生孢子以及微菌核形態(tài)4圖B.1大麗輪枝孢菌菌落、分生孢子梗和分生孢子以及微菌核形態(tài)附錄B（資料性）向日葵黃萎病病原菌形態(tài)2