第二章分光光度法

分光光度法1概述2朗白比爾定律3顯色反應(yīng)4顯色劑5測(cè)量誤差及測(cè)量條件6示差分光光度法7分光光度計(jì)1

第一節(jié)分光光度法概述1、電磁輻射光是電磁輻射。電磁輻射具有粒子的性質(zhì)，也具有波動(dòng)的性質(zhì)，其波動(dòng)性可用波長(zhǎng)（）來表示。所謂波長(zhǎng)即指在波傳播路線上具有相同振動(dòng)位相的相鄰兩點(diǎn)之間的距離。電磁輻射的粒子性的主要特征是每個(gè)光子具有能量，其與波長(zhǎng)之間的關(guān)系為：

＝ｈ?ｃ/λ

。

2電磁輻射按波長(zhǎng)順序排列，稱為電磁波譜波譜區(qū)名稱波長(zhǎng)范圍頻率范圍(MHZ)躍進(jìn)能級(jí)類型射線0.005～0.14nm6×1014～2×1012核能級(jí)X射線0.0001～10nm3×1014～3×1010

內(nèi)層電子能級(jí)遠(yuǎn)紫外光10～200nm3×1010～1.5×109內(nèi)層電子能級(jí)近紫外光200～400nm1.5×109～7.5×108原子及分子的階電子或成鍵電子能級(jí)可見光400～750nm7.5×108～4.0×108原子及分子的階電子或成鍵電子能級(jí)近紅外光0.75～2.5m4.0×108～1.2×108分子振動(dòng)能級(jí)中紅外光2.5～50m1.2×108～6.0×106分子振動(dòng)能級(jí)遠(yuǎn)紅外光50～1000m6.0×106～3×105分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)微波0.1～100cm3×105～3×102分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)射頻1～1000m3×102～0.3電子自旋/核自旋3

?

2、吸收光譜電磁輻射是物質(zhì)內(nèi)部運(yùn)動(dòng)變化的客觀反應(yīng)，任一波長(zhǎng)的光子能量與物質(zhì)內(nèi)能（原子的、分子的或原子核的）的變化E相對(duì)應(yīng)，即

E＝＝ｈ?ｃ/λ

4?3、比色法和吸光光度法?利用比較溶液顏色深淺的方法來確定溶液中有色物質(zhì)的含量，這種方法就稱為比色分析法。用眼睛觀察比較溶液顏色深淺來確定物質(zhì)含量的分析方法稱為目視比色法。利用光電效應(yīng)測(cè)量通過有色溶液后透過光的強(qiáng)度，求得被測(cè)物質(zhì)含量的方法稱為光電比色法。

?分光光度法是以棱鏡或光柵為分光器，并用狹縫分出很窄的一條波長(zhǎng)的光，并同樣測(cè)量透過光的強(qiáng)度來求得被測(cè)物質(zhì)的含量；由于光的波長(zhǎng)范圍窄，其測(cè)定的靈敏度，選擇性和準(zhǔn)確度都比比色法高。5第二節(jié)朗伯－比爾定律及其影響因素?1、朗伯－比爾定律實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)透過光強(qiáng)度與有色溶液中吸收物質(zhì)的分子數(shù)量c以及透過溶液的厚度L有關(guān)。其數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

-logⅠt/Ⅰo=kcL其中k為比例系數(shù)，其數(shù)值只取決于吸光物質(zhì)的特性，而與吸收層厚度及濃度無關(guān)。式中又稱為吸光度A，上式又可寫為A＝kcL；上式稱為朗伯－比爾定律，是紫外－可見吸收法定量分析的基礎(chǔ)。

6?2、吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)在-logⅠt/Ⅰo=kcL中，如果有色物質(zhì)溶液的濃度c用g／L表示，吸收厚度以cm表示，比例常數(shù)k稱為吸光系數(shù)。如果濃度c用mol／L表示，吸收厚度以cm表示，則比例常數(shù)k稱為摩爾吸光系數(shù)。摩爾吸光系數(shù)的單位為l／(mol.cm)。它表示物質(zhì)的濃度為1摩爾／升，液層厚度為1cm時(shí)溶液的吸光度。符號(hào)常用ε表示，因此朗伯－比爾定律又可寫成：A＝εcL

7員工隊(duì)伍規(guī)劃現(xiàn)有員工隊(duì)的描述未來的員工隊(duì)伍預(yù)測(cè)差距分析?3、吸光度可加性原理某一波長(zhǎng)的入射光通過幾個(gè)相同厚度的不同溶液，其總的吸光度為各溶液吸光度之和。同樣如果溶液中含有不同的吸光物質(zhì)，只要各組分間沒有相互作用，溶液的總吸光度為各組分吸光度之和。這就是吸光度可加性原理。吸光度可加性原理是十分有用的，例如進(jìn)行光度分析時(shí)，試劑或溶劑有吸收，則可從所測(cè)總吸光度中直接進(jìn)行扣除，這就是以試劑或溶劑做空白的依據(jù)。8主要信息來源?

4、影響朗伯－比爾定律正確性的因素?入射光非單色光嚴(yán)格講朗伯—比爾定律只適用于單色光。但目前各種方法所得到的入射光，實(shí)際上是一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，因而產(chǎn)生了對(duì)朗伯－比爾定律的偏離。?溶液中的化學(xué)反應(yīng)溶液中的吸光物質(zhì)常因離解、締合、形成新的化合物或互變異構(gòu)體等的化學(xué)變化而改變了濃度，因而導(dǎo)致對(duì)朗伯－比爾定律的偏離。?漫射：當(dāng)介質(zhì)的微粒不太小的情況下，將發(fā)生漫射，如膠溶液、乳膠液和懸浮物等。這些溶液透過光的強(qiáng)度不僅與吸收物質(zhì)的吸收有關(guān)，還與溶液的漫射性質(zhì)有關(guān)。9第三節(jié)顯色反應(yīng)及其影響因素?1、分光光度法對(duì)顯色反應(yīng)的要求?擇性好、干擾少或干擾容易消除。?敏度高。分光光度法一般用于微量組分的測(cè)定，故一般選擇生成有色化合物的摩爾吸光系數(shù)高的顯色反應(yīng)。?有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式。?有色化合物的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)足夠穩(wěn)定，至少保證在測(cè)量過程中溶液的吸光度變化很小。?有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大。10?2、影響顯色反應(yīng)的因素?

顯色劑的用量?溶液的酸度?

顯色溫度?顯色時(shí)間?溶劑?溶液中共存離子的影響11第四節(jié)顯色劑

?1、無機(jī)顯色劑?無機(jī)顯色劑在比色分析中已經(jīng)應(yīng)用不多，主要因?yàn)樯傻慕j(luò)合物不夠穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高。目前主要應(yīng)用較多的有硫氰酸鹽、鉬酸銨和過氧化氫等。12

?2、有機(jī)顯色劑

大多數(shù)有機(jī)顯色劑與金屬離子生成極穩(wěn)定的鰲合物，而且具有特征的顏色，因此選擇性和靈敏度都較高。不少鰲合物宜溶于有機(jī)溶劑，可以進(jìn)行萃取比色，這對(duì)進(jìn)一步提高靈敏度和選擇性很有利。有機(jī)顯色劑大都是含有生色團(tuán)和助色團(tuán)的化合物。在有機(jī)化合物分子中，一些含有不飽和鍵的基團(tuán)，它們能吸收大于200nm波長(zhǎng)的光這種基團(tuán)稱為廣義的生色團(tuán)。13

?1、測(cè)量誤差

許多誤差來自吸光度的定量測(cè)定。光度測(cè)定過程包括兩個(gè)階段：第一階段是化學(xué)過程，即利用各種化學(xué)反應(yīng)將待測(cè)組分的溶液用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚?，使待測(cè)組分轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ńM成的化合物，包括有色化合物及各種絡(luò)合物；第二階段是物理過程，即將經(jīng)第一階段處理的樣品置于儀器中測(cè)定吸光度或繪制吸收光譜。因此，測(cè)定過程中的誤差可以分成:

?化學(xué)誤差

?儀器的誤差

?

人為的誤差第五節(jié)測(cè)量誤差和測(cè)量條件的選擇

14?2、測(cè)量條件的選擇

?pH值的選擇

在分光光度法的定量分析中，為了選擇確定最適宜酸度，考慮到酸度值往往是最主要的影響因素，可用單因素實(shí)驗(yàn)法。常用的方法是：將具有不同pH值但含有同一量的被測(cè)物質(zhì)的一系列溶液，于分光光度計(jì)上測(cè)量其相應(yīng)吸光度值，然后以吸光度對(duì)溶液的pH或酸度作圖，得一酸度曲線。該曲線中吸光度值最大且保持不變的區(qū)間所對(duì)應(yīng)的pH值范圍，即為待測(cè)物質(zhì)分光光度測(cè)定的最適宜酸度范圍。

15?溶劑勺的選疏擇如果晚待測(cè)籌物質(zhì)繡是顯闊色測(cè)鍛定，摧應(yīng)盡辰量采相用水秩作為婆溶劑縮慧以求炮簡(jiǎn)便指，并驅(qū)防止尊分析辨人員援長(zhǎng)期柄使用屬某些音有機(jī)姿溶劑豬而中趟毒。獸如果帖水相異介質(zhì)礙測(cè)定脆達(dá)不圓到分媽析目誦的時(shí)形（例跡如靈川敏度溫差、咬干擾墓無法嘩消除兄等）辣，則屈考慮刻使用蝦有機(jī)陰溶劑恢或用寺萃取—分光撕光度就法。16?溫度間的選捐擇溫度肌變化稍不大而時(shí)，昆對(duì)分訪光光逼度法丑的影牢響甚害微，鬼故在執(zhí)定量鄉(xiāng)豐分析采中通備常不商必恒范溫。扎但若貼我們延利用旗顯色醋反應(yīng)竄將待耐測(cè)物濃質(zhì)轉(zhuǎn)封化為坡有色他化合污物進(jìn)句行測(cè)洞定，蠅則溫縫度對(duì)嶄于顯術(shù)色反神應(yīng)速揉度可嘩能有巷較大寸影響選，故黎需控豬制適躬宜溫右度使撲反應(yīng)猛進(jìn)行元完全獸，而侄且也肌必須眠考慮座在該愚溫度茂下待京測(cè)物取質(zhì)、轉(zhuǎn)顯色柴劑及模有色礙絡(luò)合檢物的鑒穩(wěn)定孫性。樸一般恐說來批，顯色炊反應(yīng)賊多在障室溫存下完就成。對(duì)改于速弄度較通慢的貸顯色平反應(yīng)肝宜選暗擇較旺高溫避度以鋒縮短杯顯色背時(shí)間響。對(duì)朋于不巴同的胖顯色穩(wěn)反應(yīng)懂應(yīng)選韻擇各浸自的朗適宜泛顯色乓溫度非。17?測(cè)定峽時(shí)間臘的選泊擇有色禍化合月物穩(wěn)堆定的秀時(shí)間舌范圍愧按下呆法確宅定：酒在加扮入顯嘗色劑估后，渴連續(xù)撞測(cè)量會(huì)和記忙錄該漂溶液碎的吸仁光度芒值。楊并以勇吸光盒度值橫對(duì)時(shí)聰間作睬圖繪應(yīng)出“時(shí)間辛曲線”。碎該曲菠線的灘平臺(tái)盞區(qū)（摧即吸霧光度攝恒定山不變稠的區(qū)監(jiān)間）蜓所對(duì)尾應(yīng)的銷時(shí)間也區(qū)間在即為輝該有色凝化合乞物穩(wěn)緣瑞定的撈時(shí)間渾范圍。吸慰光度退的測(cè)臨定應(yīng)張?jiān)诖说軙r(shí)間孔范圍宏內(nèi)盡佳快完訓(xùn)成。18?入射鴉光波沉長(zhǎng)的卷選擇根據(jù)特朗伯—比耳頂定律探可知?dú)g，在竟一定貧波長(zhǎng)禮下，論如果份液槽霜厚度乏保持聯(lián)不變除，則軌溶液疤的吸歲光度周與溶圾液的翻濃度擾成正戲比。A＝-l刪og許1王/T患=εc洋L在實(shí)釋際應(yīng)折用中龍，通常梢借助打吸收喝曲線豬來選屠擇測(cè)債定的蘋適宜劍波長(zhǎng)。所快謂吸剃收曲毀線，葉就是減使不部同波使長(zhǎng)的漏光透鴨過某興一固技定濃奸度的齒溶液胸，測(cè)勾量其揉吸光躁度。套然后摟，以腎波長(zhǎng)民為橫容坐標(biāo)們，吸偷光度畏為縱趙坐標(biāo)迅作圖紹。所總得曲莖線稱冤為吸朱收曲圖線。吸光妻度值匪最大蛙時(shí)的變波長(zhǎng)祖以λ最大表示朱，此佳波長(zhǎng)械即為濕測(cè)定略時(shí)所要選用震的入修射光稠波長(zhǎng)俗，此徹時(shí)的樣摩爾陜吸光干系數(shù)哨最大絞，測(cè)或定靈懇敏度厭最高駐。但瘋有時(shí)膠為避落免干描擾，窮不選泛擇最愧大吸指收波刷長(zhǎng)，召而選尿擇其湖次的言吸收例峰為飼工作涂波長(zhǎng)并，這翻樣雖把然靈襲敏度幻玉不是弊最高糧，但穗能避捉免干衣擾，老提高澡了方亦法的濁選擇瀉性。19?測(cè)量傅相對(duì)慚誤差特與吸與光度摩的關(guān)園系以外及吸哪光度氣范圍旋的控唐制分光遷光度亦計(jì)都紫有一漆定的污測(cè)量伐誤差這，實(shí)約踐證掙明，駕吸光冶度在0.屬2～0.股5內(nèi)測(cè)業(yè)量的誰相對(duì)鞠誤差腳最小壤。為初使被燈測(cè)溶惠液的廢吸光甘度在0.候2～0.熟5之內(nèi)燦，可爭(zhēng)以用澤下面朱兩種撓方法啊來調(diào)較整。振第一誼是控害制被慎測(cè)溶遵液的位濃度連，如檔改變依取樣估量，眨改變裂溶液耀的濃好縮倍械數(shù)或水稀釋萍倍數(shù)何。第炊二是捆選擇襖不同隙的比董色皿僅，比拼色皿增的光宰程長(zhǎng)磚度為10、30、50、10誦0m攜m，吸暮光度葉小的鼠要用詞長(zhǎng)的瓦比色胸皿，娘吸光李度大雖的溶塞液要棒用光預(yù)程短命的比膝色皿水。20?參比番溶液獵的選界擇參比章溶液仗又稱板為空優(yōu)白溶醫(yī)液或合比較淺溶液樣。嚇測(cè)量吳時(shí)選沒用何島種參延比溶準(zhǔn)液需槐視具幸體情殺況而富定。?如被攏測(cè)液鋪中，括僅顯設(shè)色劑遙與待場(chǎng)測(cè)組桿分生紙成有侄色化岡合物學(xué)，而東顯色派劑與歪其他魔試劑毯無色尿，溶錯(cuò)液中宏亦無萄其他憤有色較離子晃時(shí)，劍可用冶蒸餾鉗水或?qū)ルx恩子水遷作為疲參比呼溶液紅。?除顯圣色劑役與待監(jiān)測(cè)組榨分所壟生成甩的化紫合物刻有色熊外，春溶液貼中亦瓶存在杏其他犯有色輸離子匯，而壓且顯現(xiàn)色劑鄉(xiāng)豐無色殃，此洪時(shí)可次用不蝦加顯攔色劑無的被梅測(cè)液灶作為取參比殘溶液宅。?當(dāng)顯叛色劑亂本身嘉具有側(cè)顏色共時(shí)，捐則用知顯色峰劑溶掩液作平為參吹比溶摔液。以如果府顯色趣劑和簽被測(cè)鵲溶液性都有言色時(shí)貍，可崗將一貴份試廁液加獄入適馬當(dāng)掩宜蔽劑臣，把障被測(cè)沫組分刷掩蔽蹄起來辯，使炊之不授再與法顯色缺劑反扎應(yīng)，憐再加因入與勢(shì)被測(cè)判溶液相等息的顯隊(duì)色劑封和其蛾他試臘劑，與這樣差的參嬸比溶勵(lì)液能涌消除輪共存豪組分夾的干迷擾。21第六蠶節(jié)趣示抽差分才光光肚度法?1、示差法悉的原殼理示差衫光度襲法和儲(chǔ)一般珠的光晃度法呈不同惜之處陵主要去在于擴(kuò)，示秀差法不是床以空警白溶饅液（不含泥待測(cè)礎(chǔ)組分漲的溶頸液）涌作為務(wù)參比顧溶液岸，而畜是采用眨比待理測(cè)溶達(dá)液濃愛度稍紫低的肉標(biāo)準(zhǔn)幟溶液貫作參貸比溶搬液，然后駱測(cè)量堪待測(cè)毯溶液洽的吸平光度攔，再緣瑞從測(cè)膏得的值吸光州度求叮出它聞的濃是度。設(shè)用肺作參除比的滿標(biāo)準(zhǔn)刷溶液澆濃度省為cs，待根測(cè)溶甘液濃甘度為cx，且cx>cs，根牙據(jù)朗兔伯—比耳睛定律民得到Ax=εcxbAs=εcsb兩式爽相減未：A相對(duì)=Ax-As=εb（cx-cs）=εb墻Δc（2-峽12）實(shí)際講操作諒是：粗用已抽知濃及度的墾標(biāo)準(zhǔn)垮溶液那作參辦比股，調(diào)棟節(jié)其巴吸光岸度為另零（涉透光泛率10鋸0%），況然后踢測(cè)量常待測(cè)籠溶液籍的吸啊光度貢。這西時(shí)測(cè)盡得的猴吸光耳度實(shí)雖際是沃這兩對(duì)種溶浴液吸寧光度唯的差鑄值（膊相對(duì)縮慧吸光繭度）召。從之（2-惰12）式效可知忌，所對(duì)測(cè)得清的吸雞光度喇差值旁與這弱兩種徑溶液紀(jì)的濃搭度差趟成正滔比。配這樣肌便可免以把乏空白羞溶液躺為參量比的霸稀溶誤液標(biāo)不準(zhǔn)曲鋪線作縣為ΔA對(duì)應(yīng)般于Δc的工吃作曲租線，殼根據(jù)姨測(cè)得劑的ΔA找出流相應(yīng)擋的Δc值，隊(duì)從cx=cs+Δc，便喝可求仔出待膛測(cè)溶店液之菊濃度嚼，這萄就是廁示差筒法定對(duì)量測(cè)德定的準(zhǔn)基本浙原理俊。222、示其差法勸的誤陰差Ho姻w輸mu催chHo徹w盲co對(duì)mp片et叔e(cuò)n塊t示差曠法標(biāo)雙尺原慰理按一桐般分撇光光丘度法柏用試談劑空錫白作何參比租溶液忙，測(cè)已得溶待液的搶透光察率Tx=6較%，顯應(yīng)然，自這時(shí)潛的測(cè)哄量讀訴數(shù)誤降差是宣很大墊的。貼采用斯示差現(xiàn)法時(shí)繭，如項(xiàng)果按全一般法分光建光度她法測(cè)去得的Ts=1移0%的標(biāo)仍準(zhǔn)溶潮液作派參比棵溶液平，使株其透捎光率奧從標(biāo)按尺上Ts墨1=1趁0%處調(diào)痕至Ts巨2=1善00躬%處，譯相當(dāng)給于把蓄檢流穿計(jì)上彩的標(biāo)緣瑞尺擴(kuò)釋展到繩原來做的十推倍（TS2/TS1=1惹00留/1瓶0=義10），名這樣貨待測(cè)沸試液負(fù)透光屋率原弱來為6%，讀能數(shù)落嶄在光膝度計(jì)椅標(biāo)尺功刻度陣很密港，測(cè)痕量誤釀差很鐵大的醋區(qū)域驢，改吃用示莫差法趁測(cè)定雕時(shí)，裳透光份率則它是60當(dāng)%，讀客數(shù)落汽在測(cè)辭量誤紐奉差很渡小的棕區(qū)域箏，從蘇而提影高了翠測(cè)定屈的準(zhǔn)街確度縣。計(jì)桌算出峽來的cx當(dāng)然材比較雹準(zhǔn)確芹了。23第七料節(jié)暑分?jǐn)偣夤鈧愣扔?jì)?1、分延光光掌度計(jì)?儀器匹簡(jiǎn)介任何佩類型擔(dān)的分尿光光織度計(jì)田都配錄備下簽列組駐成部燥分：死光源憐、單賢色器妥、吸親收池僚、檢思測(cè)器青和顯屢示儀藍(lán)表等替。國(guó)內(nèi)此比較咸常用差的紫揉外－惑可見去分光搜光度躲計(jì)有姥單光甚束和造雙光悶束兩激種類充型。24儀器斬的裝進(jìn)置原亡理單光井束裝葬置光源單色哈儀空白仇或樣菊品吸挖收器檢測(cè)清器單光泄束分筐光光例度計(jì)雙光牢束裝尊置切光緒器空白樣品檢測(cè)汁器雙光遼束分魚光光財(cái)度計(jì)25試驗(yàn)綠室常辮用的72拘1型分且光光陷度計(jì)其就是腸單光閉束的宋分光筒光度抬計(jì)，爐日立U2炸80音0、島皮津的UV－17液00型分心光光跌度計(jì)情是雙獵光束根的分莫光光撫度計(jì)丹。此外扁，雙煎波長(zhǎng)使分光免光度膠計(jì)在埋分析