測序原理及特點課件

3730xl測序儀的原理

雙脫氧鏈終止法測序原理

3730xl測序儀的構造

3730xl測序儀的特點

測序基本流程3730xl測序儀的應用文庫類型及特點Sanger測序法的原理

1977年，英國人FredSanger發(fā)現，如果在DNA復制過程中摻入ddNTP，就會產生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長度分辨。不同末端終止DNA鏈的長度是由摻入到新合成鏈上隨機位置的ddNTP決定的。由此誕生了以Sanger命名的測序原理即雙脫氧鏈終止法測序原理。DNA測序的雙脫氧鏈末端合成終止法. Sanger法測序的原理：用DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段進行檢測。5′磷酸3′羥基3′,5′-磷酸二酯鍵核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵示意圖核酸序列形成的基礎“雙脫氧末端終止”的含義原理:在一端引物上標記特定的熒光,通過PCR產物長度大小，檢測基因型.內標選擇:1、熒光.(引物上物加的熒光的類型)Liz500：FAM(藍色),VIC(綠色),NED(紅色),HEX(黑色)Liz120；ROX500(FAM,JOE,NED,PET)2、目的片斷的大小.Liz500(35-500bp),Liz120(15-120bp)TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA終止物標記方法因為顏色不同，4種終止物可以在一起進行反應。模板DNA引物primerdATP,dTTP,dCTP,dGTP帶熒光標記的ddNTPSanger測序——雙脫氧末端終止法ddNTP被加到正在合成的鏈上，由于它的3’-OH已被氧化，下一個dNTP的5’-磷酸基團不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。在引物等延伸反應過程中，ddNTP在不同位置摻入，產生了一系列不同長度的新的DNA片段。5’3’5’3’3730xlSequenceMap測序反應與PCR的比較

PCR測序反應

DNA聚合酶Taq酶測序酶引物一對單向底物dNTPdNTP+ddNTP*

模板量少質量要求高產物等長的DNA片段相差一個堿基的一系l列片段熒光標記無3’端帶熒光標記測序產物指數擴增線性擴增3730xl測序儀的構造

遺傳分析儀系統(tǒng)組成主機電腦及軟件耗材照明燈開關狀態(tài)指示燈電源開關進樣器按鈕Buffer槽Water槽樣品艙門指示燈Waste槽加熱爐門樣品倉門灌膠泵系統(tǒng)加熱爐泵膠塊膠管膠瓶陽極緩沖液杯下膠塊連接管毛細管

加熱爐內倉96道毛細管同時檢測Capillary3730XL測序原理3730xl測序儀的特點

1電進樣及電泳用“電進樣”的方法將帶電的樣品分子加到灌好電泳膠的毛細管的進樣端（負極）。然后在毛細管兩端加上直流電壓，樣品中不同大小的DNA片段開始由負極向正極移動，移動的速度受到片段自身大小的影響，片段越短移動的越快。電泳的結果是使長度不同的帶電DNA片段互相分離，并且按片段的長短的順序通過檢測窗口，產生信號，短片段先達到檢測窗口。2熒光激發(fā)和檢測分別帶4色熒光標記的DNA片段 從小到大依次經過激光檢測區(qū)2. 激光激發(fā)熒光 產生長波長的熒光信號3. 熒光信號被冷CCD收集4. 軟件將光學信號轉換成電泳圖譜

檢測窗口雙束激光激發(fā)負極正極

光柵全波長分光低溫CCD實時檢測電泳方向大小相差1bp的帶熒光標記的DNA單鏈激發(fā)：DualSideIllumination

雙束激光兩側同時激發(fā)：靈敏度+均勻性+超速測序TopbeamBlockedBothBeamsBottomBeamBlocked檢測：光柵+低溫CCD

同步成像支持4色或5色以上熒光，適用于多種商品化試劑盒。更新熒光化學時無需更換任何硬件設備低溫CCD有效提高信噪比，準確度高。光柵全波長分光低溫CCD實時檢測CCD檢測器把檢測到的熒光信號轉換為電信號，并把它傳送給安裝了DataCollection（簡稱DC）DC接收到信號后，用預先設置好的方式進行初步處理，并把這些數據存貯在計算機的數據庫里DC會自動地從數據庫中提取這些數據，并根據不同的運行模式，完成對樣品DNA的堿基序列或片斷信息的分析，然后把分析完成后的結果數據以樣品文件的形式保存于計算機的硬盤中FullyIntegratedSystem3730xl型遺傳分析儀雙光束激光實時激發(fā)熒光全波長實時熒光檢測：光柵分光，后置超簿型CCD檢測96個樣品自動進樣及一體化16板自動進樣樣品架內置樣品板條形碼自動識別100次（9600個樣品）運行試劑一次上機自動堿基識別與質量評分軟件長讀測序POP-7液體分離膠，動態(tài)內鍍毛細管電泳溫度18-70

C可調DNA測序基本流程

準備模板：質粒、PCR產物抽樣檢查DNA濃度和質量，必要時純化測序PCR反應純化測序產物變性上機電泳分析數據DNA測序技術應用測序的應用

基因組DNA測序cDNA測序未知序列測序已知序列再測序質粒、PCR產物BAC、YAC細菌基因組DNA法醫(yī)：線粒體DNA測序LongreadwithBigDye?Terminatorv3.1:>1010bp長片段測序ACCGTCTTGACCTCGTACGCATGAACCGTCCTGACCTCGTACGCATGA基因測序的重要工作：雜合子位點識別ACGT雜合子測序雜合子檢測：發(fā)現新突變位點再測序人類基因組計劃的完成，為遺傳分析開創(chuàng)了新的研究領域其他物種的測序項目已經啟動再測序項目的特點可以更好的理解遺傳多樣性在疾病中的作用可以在各種規(guī)模的實驗室中進行，而不是僅限于基因組測序中心要求更高質量的數據基因分析技術

在生物、醫(yī)學、農牧業(yè)領域的應用

DNA測序

人類功能基因再測序細菌、真菌等微生物鑒定；HLA配型基因突變檢測

SNP檢測SNaPshotMultiplexSNPlex二重TaqMan探針片段分析基于STR的法醫(yī)個體識別與親子鑒定：HID基于STR的致病基因連鎖定位：LMS基因突變篩選

：SSCP農牧業(yè)育種：AFLP

基因表達定量TaqMan探針法與熒光染料法STR遺傳標記基因分型CNV遺傳標記在MLPA反應的結果原理：單堿基延伸,單堿基測序.利用延伸引物對PCR產物進行單個堿基的延伸,并引入尾部的熒光.其熒光的顏色及其熒光出現的位置進行區(qū)分其基因型SnapSHot技術優(yōu)點：可以研究樣本量少,snp位點多,位點間物理距離較遠的SNP檢測.SNP遺傳標記在SnapSHot反應的結果5417G663A13010G4216T4491C10646G11719A4715T4833T12406G5301T13263A7028T14569G12705T15607A9824A5178A3010T文庫類型及特點基因文庫（GeneLibrary）基因組文庫（GenomicLibrary）cDNA文庫（cDNALibrary）基因組文庫含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和基因組文庫常用的載體及特點質粒載體

簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物，如：pBR322,pUC18,pGEMλ噬菌體載體

由λ噬菌體改建而來，需要在體外包裝成噬菌體顆粒，再轉染受體細胞粘質粒載體（cosmid)

具有質粒和λ噬菌體兩種載體的性質人工染色體

能容納大片段的外源DNA。如YAC(酵母人工染色體），BAC(細菌人工染色體），PAC(P1來源的人工染色體），MAC（哺乳動物人工染色體）各種克隆載體的比較載體受體細胞結構插入大小適用pUC18/19質粒E.coli環(huán)形質粒<10kb亞克隆文庫λ噬菌體E.coli線性載體~24kb基因組文庫粘質粒E.coli環(huán)形質粒35~45kb基因組文庫BACE.coli環(huán)形質粒100~300kb基因組文庫PACE.coli環(huán)形質粒100~300kb基因組文庫YAC酵母細胞線性染色體100~2000kb基因組文庫MAC哺乳類細胞線性染色體>1000kb基因組文庫cDNA文庫直接以完整的mRNA為模板反轉錄成的全長cDNA分子與克隆載體連接后，轉導到寄主細胞，經復制形成的在寄主細胞中保存的許多克隆

分類質粒cDNA文庫噬菌體cDNA文庫

表達文庫非表達文庫未處理cDNA文庫均一化cDNA文庫差減cDNA文庫普通cDNA文庫應用領域發(fā)現SNP

克隆新基因基因表達譜分析從EST中發(fā)掘SSR標記

挖掘與病害、發(fā)育等功能相關的關鍵基因開展轉基因等功能研究，以改變某生物的性狀。保護瀕危珍惜生物資源，建立該生物的基因庫。EST可以作為構建分子標記連鎖圖譜所用的探針普通cDNA文庫構建基本流程雙鏈cDNA末端的磷酸化及酶切提取totalRNA分離mRNA合成一鏈cDNA

合成二鏈cDNA雙鏈cDNA末端補平加接頭膠回收cDNA連接電轉化鑒定庫容及插入子大小文庫送檢1d1d1d1d2d4d建立cDNA