薄層色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

年4月19日薄層色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文檔僅供參考標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程STANDARDOPERATIONPROCEDURE編號(hào)SOP-02-QC-014題目薄層色譜法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程版本號(hào)0.0生效日期12月1日編制部門(mén)QC簽名/日期審核部門(mén)QC經(jīng)理簽名/日期審核部門(mén)QA經(jīng)理簽名/日期批準(zhǔn)質(zhì)量副總經(jīng)理簽名/日期頒發(fā)部門(mén)質(zhì)量保證部分發(fā)部門(mén)QC1目的：規(guī)范薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，使其操作過(guò)程規(guī)范化，避免人為錯(cuò)誤。2適用范圍：適用于薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)操作。3責(zé)任：QC人員對(duì)本SOP實(shí)施負(fù)責(zé)。4內(nèi)容薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比，亦可用薄層色譜掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測(cè)定。4.1.儀器與材料4.1.1.薄層板按支持物的材質(zhì)分為玻璃板、塑料板或鋁板；按固定相種類(lèi)分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常見(jiàn)的有硅膠G、硅膠、硅膠H、硅膠、G、H表示含或不含石膏黏合劑。為在紫外光254nm波長(zhǎng)下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10?40μm)和髙效薄層板(5?10μm)。在保證色譜質(zhì)量的前提下，可對(duì)薄層板進(jìn)行特別處理和化學(xué)改性以適應(yīng)分離的要求，可用實(shí)驗(yàn)室自制的薄層板。固定相顆粒大小一般要求粒徑為10?40μm。玻璃板應(yīng)光滑、平整，洗凈后不附水珠。4.1.2.點(diǎn)樣器一般采用微升毛細(xì)管或手動(dòng)、半自動(dòng)、全自動(dòng)點(diǎn)樣器材。4.1.3.展開(kāi)容器上行展開(kāi)一般可用適合薄層板大小的專(zhuān)用平底或雙槽展開(kāi)缸，展開(kāi)時(shí)需能密閉。水平展開(kāi)用專(zhuān)用的水平展開(kāi)槽。4.1.4.顯色裝置噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細(xì)霧狀噴出；浸漬顯色可用專(zhuān)用玻璃器械或者適宜的展開(kāi)缸代用；蒸汽熏蒸顯色可用雙槽展開(kāi)缸或適宜大小的干燥器代替。4.1.5檢視裝置為裝有可見(jiàn)光、254nm、365nm紫外光光源及相應(yīng)的濾光片的暗箱，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。暗箱內(nèi)光源應(yīng)有足夠的光照度。4.1.6.薄層色譜掃描儀系指用一定波長(zhǎng)的光對(duì)薄層板上有吸收的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)，進(jìn)行掃描，將掃描得到的譜圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)用于物質(zhì)定性或定量的分析儀器。4.2.操作方法4.2.1.薄層板制備市售薄層板臨用一般應(yīng)在110°C活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板、塑料薄層板可根據(jù)需要剪裁，但須注意裁后的薄層板底邊的固定相層不得有破損。如在存放期間空氣中雜質(zhì)污染，用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶劑在展開(kāi)缸中上行展開(kāi)預(yù)洗，晾干，110℃活化，置干燥器中備用。自制薄層板除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水(或加有黏合劑的水溶液，如0.2%?0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液，或規(guī)定度的改性劑溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布進(jìn)行涂布（厚度為0.2?0.3mm)，取下涂好薄層的玻板，置水平臺(tái)上于室溫下晾干后，在110℃烘30分鐘，隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表面應(yīng)均勻、平整、光滑，而且無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染。4.2.2.點(diǎn)樣除另有規(guī)定外，在潔凈干燥的環(huán)境中，用專(zhuān)用的毛細(xì)管點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，位置應(yīng)正確、集中。點(diǎn)樣：基線距底邊10～15mm,高效薄層板一般基線離底邊為8～10mm,圓點(diǎn)狀直徑一般不大于4mm，高效薄層板一般不大于2mm，接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層表面，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜，一般不少于8mm，高效薄層供試品間距不小于5mm。4.2.3.展開(kāi)將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開(kāi)缸中，浸入展開(kāi)劑的深度為距圓點(diǎn)5mm為宜，密閉。除另有規(guī)定外，一般上行展開(kāi)8～15cm，高效薄層板上行展開(kāi)5～8cm，溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測(cè)。展開(kāi)前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開(kāi)缸中加入適量的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15~30分鐘。溶劑蒸氣預(yù)平衡后。應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開(kāi)。如需使展開(kāi)缸達(dá)到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則需在展開(kāi)缸內(nèi)壁貼與展開(kāi)缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開(kāi)劑中，密閉一定時(shí)間，使溶劑蒸氣達(dá)到飽和再如法展開(kāi)。必要時(shí)，可進(jìn)行二次展開(kāi)或雙向展開(kāi)，進(jìn)行第二次展開(kāi)前，應(yīng)使薄層板殘留的展開(kāi)劑完全揮干。4.2.4.顯色與檢視有顏色的物質(zhì)可在可見(jiàn)光下直接檢視，無(wú)色物質(zhì)可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在可見(jiàn)光下檢視，有熒光的物質(zhì)或顯色后可激發(fā)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可在紫外光燈（365nm或254nm）下觀察熒光斑點(diǎn)。對(duì)于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠板），在254nm紫外光下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質(zhì)形成的斑點(diǎn)。4.2.5.記錄薄層色譜圖像一般可用攝像設(shè)備拍攝，以光學(xué)照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀記錄相應(yīng)的色譜圖。4.3.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按各品種下要求對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，即供試品和對(duì)照品對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)符合規(guī)定的要求。4.3.1.比移值指基線至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離與基線至展開(kāi)劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時(shí)，各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值以在0.1-0.8之間為宜。4.3.2.檢出限指限量檢查或雜質(zhì)檢查時(shí)，供試品溶液中被測(cè)物質(zhì)能被檢出的最低濃度或量。一般采用已知濃度的供試品溶液或?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)溶液，與稀釋若干倍的自身對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液在規(guī)定的色譜條件下，在同一薄層色譜板上點(diǎn)樣、展開(kāi)、檢視，后者顯清晰可辨斑點(diǎn)的濃度或量作為檢出限。4.3.3.分離度鑒別時(shí)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜中的斑點(diǎn)均應(yīng)清晰分離。當(dāng)薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計(jì)算公式為：R=2式中為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離為相鄰兩峰各自的峰寬除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.0在化學(xué)藥品雜質(zhì)檢查的方法選擇時(shí)，將雜質(zhì)對(duì)照品用供試品自身釋的對(duì)照溶液溶解制成混合對(duì)照溶液，也可將雜質(zhì)對(duì)照品用待測(cè)組分的對(duì)照品溶液溶解制成混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，還可采用供試品以適當(dāng)?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液，上述溶液點(diǎn)樣展開(kāi)后的色譜圖中，應(yīng)顯示清晰分離的斑點(diǎn)。4.3.4.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差薄層掃描含量測(cè)定時(shí)，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%；需顯色后測(cè)定的或者異板的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于10.0%。4.4.測(cè)定法(1)鑒別按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點(diǎn)的位置和顏色（或熒光)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖的斑點(diǎn)一致。必要時(shí)化學(xué)藥品可采用供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液混合點(diǎn)樣、展開(kāi)，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相應(yīng)斑點(diǎn)應(yīng)為單一、緊密斑點(diǎn)。(2)限量檢査與雜質(zhì)檢査按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣、展開(kāi)和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點(diǎn)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑點(diǎn)比較，顏色(或熒光)不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測(cè)定峰面積值，供試品色譜圖中相應(yīng)斑點(diǎn)的峰面積值不得大于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積值。含量限度檢查應(yīng)按規(guī)定測(cè)定限量?；瘜W(xué)藥品雜質(zhì)檢查可采用雜質(zhì)對(duì)照法、供試品溶液的自身稀釋對(duì)照法、或兩法并用。供試品溶液除主斑點(diǎn)外的其它斑點(diǎn)與相應(yīng)的雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液或系列濃度雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深，或與供試品溶液自身稀釋對(duì)照溶液或系列濃度自身稀釋對(duì)照溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深。一般應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)和單一雜質(zhì)量，當(dāng)采用系列自身稀釋對(duì)照溶液時(shí)，也可規(guī)定估計(jì)的雜質(zhì)總量。(3）含量測(cè)定照薄層色譜掃描法，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣、展開(kāi)、掃描測(cè)定?；?qū)⒋郎y(cè)色譜斑點(diǎn)刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定。4.5.薄層色譜掃描法系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見(jiàn)光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測(cè)定。可根據(jù)不同薄層色譜掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，按照規(guī)定方式掃描測(cè)定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規(guī)定外，含量測(cè)定應(yīng)用市售薄層板。掃描方法采用單波長(zhǎng)掃描或雙波長(zhǎng)掃描。如采用雙波長(zhǎng)掃描，應(yīng)選用待測(cè)斑點(diǎn)無(wú)吸收或最小吸收的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)，供試品色譜圖中待測(cè)斑點(diǎn)的比移值(值）、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測(cè)得的光譜最大吸收和最小吸收應(yīng)與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液相符，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。薄層色譜掃描定量測(cè)定應(yīng)保證供試品斑點(diǎn)的量在線性范圍內(nèi)，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同板點(diǎn)樣、展開(kāi)、掃描、測(cè)定和