淺論仙人掌對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞生長增殖的影響

淺論仙人掌對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞生長增殖的影響【摘要】目的：觀察仙人掌對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響及其量-效關(guān)系。方法：以小鼠成纖維細(xì)胞株(NIH3T3)為研究對(duì)象，采用四氮唑鹽(MTT)比色法測定仙人掌對(duì)成纖維細(xì)胞增生的影響(以O(shè)D值反映細(xì)胞活性)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測成纖維細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。結(jié)果：在一定濃度范圍內(nèi)(～mg/mL)，仙人掌能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長增殖，同時(shí)促進(jìn)PCNA蛋白的表達(dá)，并隨著仙人掌濃度的增加，成纖維細(xì)胞數(shù)量和PCNA蛋白的表達(dá)均不斷增加，在mg/mL濃度時(shí)達(dá)到高峰，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r分別為，;P均)。結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，仙人掌具有促進(jìn)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的作用，并表現(xiàn)為明顯的量-效關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】仙人掌;成纖維細(xì)胞;增殖

Abstract:Objective:ToexploretheeffectsofOpuntiaonfibroblastproliferationinvitroanditsconcentration-effectrelationship.Methods:TheeffectsofOpuntiaonproliferationoffibroblastweremeasuredwithMTTcolorimetricassay，andPCNAproductionswereexaminedwithimmunocytechemistry.Results:OpuntiacouldprovokefibroblastproliferationandincreasePCNAproteinexpressioninconcentrationrange～mg/mL.Furthermore，theeffectsexhibitedasignificantconcentration-dependentrelationship(r=，respectively，P).Conclusion:Opuntiacanprovokefibroblastproliferationwithinacertainconcentrationrange，whichexhibitsasignificantconcentration-effectrelationship.

Keywords:Opuntia;fibroblast;proliferation

仙人掌(Opuntia)，又名神仙掌、老鴉舌、觀音掌等，已經(jīng)被用來治療糖尿病、潰瘍等癥[1-2]。仙人掌治療胃潰瘍的機(jī)制可能與成纖維細(xì)胞的增殖有關(guān)。近幾年來，雖然仙人掌的藥理作用已成為醫(yī)學(xué)熱門研究方向，但有關(guān)仙人掌對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增殖的影響未見報(bào)道。本研究以體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察仙人掌對(duì)成纖維細(xì)胞生長增殖的影響及其量-效關(guān)系。

1材料和方法

材料小鼠成纖維細(xì)胞株(NIH3T3)購自上?？蠌?qiáng)儀器有限公司，鼠抗人PCNA單克隆抗體及其他試劑均購自武漢博士德生物有限公司。仙人掌干粉為鮮莖片80℃烘干制成，由福州日冕科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)提供。

方法

藥物處理：將仙人掌粉溶于80℃左右蒸餾水中，制成不同濃度溶液，經(jīng)1500r/min離心5min，取上清液，調(diào)節(jié)pH值為～，高壓蒸汽滅菌20min，冰箱中(-18℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

采用四氮唑鹽(MTT)比色法測定仙人掌對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響：取NIH3T3對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞為5×104個(gè)/mL，以每孔104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分成6組，第1組只加入無血清DMEM50μL作為空白對(duì)照組;2～6組加入等量的用無血清DMEM配制的仙人掌干粉液，濃度分別為：、、、、1mg/mL。37℃5%CO2條件下培養(yǎng)48h，吸出培養(yǎng)液，各孔加入20μL的MTT液(以不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配置，濃度為5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。應(yīng)用酶標(biāo)儀490nm處測定各孔的吸光值(OD值)。

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)測定仙人掌對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)的影響：將NIH3T3細(xì)胞接種于含玻片的12孔板中培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后第1組只加無血清DMEM作為空白對(duì)照組;第2～第6組加入等量的用無血清DMEM配制的仙人掌干粉液，濃度分別為、、、、1mg/mL。培養(yǎng)48h后撤藥，加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出長有細(xì)胞的玻片固定，用鼠抗人細(xì)胞PCNA單克隆抗體作第一抗體，SABC法行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。顯微鏡(×400)下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞(棕黃色染色)數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比率。具體操作過程嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

同時(shí)設(shè)空白對(duì)照試驗(yàn)：用PBS代替一抗，余步驟同上。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法組間比較用One-WayANOVA分析后，采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Bivariate過程的Pearson相關(guān)分析法。

2結(jié)果

仙人掌對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響在一定濃度范圍內(nèi)(～mg/mL)，仙人掌能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長增殖，在mg/mL濃度時(shí)達(dá)到高峰，并隨著仙人掌濃度的增加，成纖維細(xì)胞數(shù)量也不斷增加，表現(xiàn)為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r為，P)。但是當(dāng)仙人掌濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，不影響成纖維細(xì)胞生長增殖，見表1。

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)測定仙人掌對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)PCNA的影響一定濃度范圍內(nèi)(～mg/mL)的仙人掌能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，在mg/mL濃度時(shí)達(dá)到高峰，并表現(xiàn)為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即隨著仙人掌濃度的增加，其表達(dá)量不斷增加(r為，P)。但是當(dāng)仙人掌濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，不影響PCNA蛋白的表達(dá)，見表2。

3討論

仙人掌作為天然中草藥，具有作用范圍廣、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，其化學(xué)成分復(fù)雜，含有有機(jī)酸類、甾醇類、黃酮類、生物堿類、糖類和萜類。其中的黃酮含量較高，且主要以蘆丁和槲皮素為主，干物質(zhì)中總量達(dá)到了%，其中蘆丁含量達(dá)%，槲皮素含量達(dá)%。蘆丁、槲皮素具有維持毛細(xì)血管通透性，防止血細(xì)胞凝集，降血脂，抗氧化等多種生物活性;仙人掌還富含鉀、鈣、銅、鐵、錳、鋅等營養(yǎng)元素及果膠。仙人掌的藥用價(jià)值最先記載于清代趙學(xué)敏所著的《本草綱目拾遺》中，其功能有行氣活血、清熱解毒、消腫止痛、健脾止瀉、安神利尿，可內(nèi)服、外用治療多種疾病。近幾十年國內(nèi)外的研究表明，仙人掌提取液具有抑菌、降血糖、降血壓、抗腫瘤、提高免疫機(jī)能等多種藥理作用。

成纖維細(xì)胞是創(chuàng)傷修復(fù)最主要的細(xì)胞。創(chuàng)傷后，成纖維細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，并合成、分泌膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白質(zhì)和蛋白多糖)成分，參與肉芽組織形成、創(chuàng)口收縮及組織重建的過程，其數(shù)量變化會(huì)對(duì)創(chuàng)傷愈合產(chǎn)生巨大影響。本研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)(～mg/mL)，仙人掌能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長增殖，并表現(xiàn)為明顯的量-效關(guān)系，即隨著仙人掌濃度的增加，成纖維細(xì)胞數(shù)量也不斷增加，在mg/mL時(shí)達(dá)到高峰。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)亦名細(xì)胞周期蛋白，是與細(xì)胞周期相關(guān)的核蛋白，它被認(rèn)為是真核細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶δ的一種輔助蛋白。PCNA直接參與DNA的合成，在靜止期細(xì)胞內(nèi)含量很低，自G1晚期逐漸增加，到S期其量達(dá)到高峰。PCNA的免疫定位已成為檢測細(xì)胞增殖活性最有效的標(biāo)志之一[8-9]。在本實(shí)驗(yàn)中，一定濃度范圍內(nèi)(～mg/mL)的仙人掌能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)量，并表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞增殖一致的量-效關(guān)系，在mg/mL濃度時(shí)亦達(dá)到高峰，表明仙人掌在一定濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)機(jī)體合成PCNA，加快細(xì)胞的增殖。

但有研究報(bào)道，在活體實(shí)驗(yàn)中，仙人掌提取物具有降低兔耳腹側(cè)增生性瘢痕組織塊中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，促進(jìn)Ⅲ型膠原蛋白表達(dá);同時(shí)使基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)表達(dá)升高，加速Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的降解，從而減輕瘢痕增生，促使已形成的增生性瘢痕組織塊軟化、吸收[10]。我們在本研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)仙人掌濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，將不影響成纖維細(xì)胞生長增殖和PCNA蛋白的表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)其抑制作用。

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