分子生物學(xué)第四章復(fù)制

分子生物學(xué)第四章復(fù)制第一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第一節(jié)基本概念第二節(jié)復(fù)制概況第三節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

第四節(jié)DNA復(fù)制的半不連續(xù)性第五節(jié)原核生物DNA復(fù)制（E.coli）

第六節(jié)真核生物DNA復(fù)制第二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

第一節(jié)基本概念

(BasicConcept)第三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五DNA復(fù)制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補(bǔ)配對(duì)的游離的dNTP,

合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過(guò)程?！?/p>

復(fù)制子（Replicon）；又稱(chēng)復(fù)制單位或復(fù)制元AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

DNA中含有一定復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn)的復(fù)制單位

1.3萬(wàn)～90萬(wàn)不等第四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五●復(fù)制體（Replisome）Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA復(fù)制叉處的許多酶和蛋白組成的復(fù)合體，協(xié)同動(dòng)作合成DNA第五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五DNA復(fù)制在細(xì)胞周期的S期E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell500-5000bp/min第六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二節(jié)復(fù)制概況

(SurveysofReplication)第七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、DNA的半保留復(fù)制（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl設(shè)計(jì)的CsCl超離心試驗(yàn)證實(shí)了

DNA復(fù)制的這一特性概念：復(fù)制過(guò)程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模

板合成其互補(bǔ)鏈，新生的互補(bǔ)鏈與母鏈構(gòu)成子

代DNA分子第八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五15N標(biāo)記實(shí)驗(yàn)·細(xì)胞生長(zhǎng)在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中·轉(zhuǎn)入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標(biāo)記DNA未標(biāo)記DNACsCL密度梯度離心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml第九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

二、復(fù)制起點(diǎn)、方式和方向1、復(fù)制起點(diǎn)（originori或o復(fù)制原點(diǎn)）復(fù)制開(kāi)始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：?jiǎn)螐?fù)制起點(diǎn)即－－整個(gè)染色體只有一個(gè)復(fù)制單位

第十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

真核生物（Eukaryote）:多復(fù)制起點(diǎn)即－－一個(gè)genome中有多個(gè)復(fù)制單位第十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五Replicationfork第十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

富含AT&發(fā)夾結(jié)構(gòu)“呼吸作用”十分明顯許多酶的結(jié)合位點(diǎn)300bp±

真核生物的復(fù)制原點(diǎn)ATrich第十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

復(fù)制叉（Replicationfork）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)

2、復(fù)制方向（復(fù)制過(guò)程的順序性）

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛第十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五真核生物的多復(fù)制子多個(gè)復(fù)制眼第十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

（1）單雙向復(fù)制取決于起點(diǎn)處有一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉

單向復(fù)制

雙向復(fù)制第十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）復(fù)制的多模式單起點(diǎn)、單方向（原核）多起點(diǎn)、單方向（真核）單起點(diǎn)、雙方向（原核）多起點(diǎn)、雙方向（真核）第十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、復(fù)制方式大多數(shù)以對(duì)稱(chēng)方式進(jìn)行－－即兩條鏈同時(shí)復(fù)制也有一定時(shí)期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈的情況

（1）從新起始（denovoinitiation

）或復(fù)制叉式（replicationfork）

比較形象的－－θ

復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制眼可以形成一種θ結(jié)構(gòu)，形狀像希臘字母θ，因而叫….第二十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.第二十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

單、雙向θ

復(fù)制模式圖單向復(fù)制雙向復(fù)制第二十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

（2）置換式（Displacementform

）又稱(chēng)D環(huán)復(fù)制

兩條鏈的合成高度不對(duì)稱(chēng),一條鏈迅速合成出互補(bǔ)鏈,另一條則形成游離的單鏈環(huán)(D-環(huán))

線(xiàn)粒體和葉綠體

DNA的復(fù)制方式第二十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）共價(jià)延伸方式（covalenceelongation）或滾環(huán)式復(fù)制（rollingcirclereplication）由于復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，又稱(chēng)σ復(fù)制

病毒、細(xì)菌因子第二十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第三節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

(EnzymologyofDNAReplication)第二十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

一、DNA聚合反應(yīng)和聚合酶1957ArthurKornberg首次發(fā)現(xiàn)DNApolⅠ

DNApolⅡ

DNApolⅢ

（E.coli）

聚合反應(yīng)：底物－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→

Poly(核苷酸)n+1－3’-OH

＋2Pi

第二十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

二、三種DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能（P112）第二十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

其中DNApolⅢ

全酶有十種共22個(gè)亞基β二聚體－－滑動(dòng)鉗第二十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五DNApolⅢ全酶的非對(duì)稱(chēng)二聚體第二十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第三十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能

1、DNA聚合酶活性：兩者都有條件－－模板、引物

DNApolⅠ－－主要用于DNA

的修復(fù)和RNA引物的替換

DNApolⅢ－－DNA鏈的延長(zhǎng)聚合方向：5’－3’第三十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

2、3’－5’外切核酸酶活性

校對(duì)功能(proofreading)第三十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第三十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、5’－3’外切核酸酶活性

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三個(gè)特點(diǎn)：

?必須有5’－磷酸末端?被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對(duì)的?被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移，Nicktranslation）第三十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五該反應(yīng)具有巨大的實(shí)用價(jià)值，切口平移是體外在DNA分子上引入放射性標(biāo)記核苷酸的主要技術(shù)。第三十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五4、子鏈DNA延伸方向只能是5’－3’已知的DNA聚合酶只能使鏈按5’－3’方向生長(zhǎng)5’OHTCATCA

C5’OH3’pppOHC++ppi

P123頁(yè)第三十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

ATCG

5’pppOH3’第三十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’pppa、因能量的需要，

DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理環(huán)境中，使dNTP難以聚合到DNA的5’端需要其他機(jī)制以解脫第三十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五b、堿基發(fā)生錯(cuò)配后的校正……費(fèi)時(shí)、費(fèi)能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗

ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpp

pOH第三十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

三、DNA連接酶（DNALigase）

所需條件：

a、

切刻的3’－OH和5’－P相鄰

b、

切刻各自堿基處于配對(duì)狀態(tài)

c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）

用途：復(fù)制過(guò)程中，5’端RNA引物被置換后切刻的連接

修復(fù)、重組NAD——煙酰胺腺嘌呤二核苷酸第四十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五酶-AMP復(fù)合物形成

酶復(fù)合物的AMP和缺口的5‘-磷酸相連，隨后與此缺口的3’-OH形成磷酸二酯鍵，并放出酶和AMP第四十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

四、與DNA幾何學(xué)性質(zhì)相關(guān)的酶1、解螺旋酶（helicase）:又稱(chēng)解旋酶是使DNA兩條鏈分開(kāi)的酶，通常利用ATP水解提供必需的能量。單鏈結(jié)合蛋白（SSBsingle-strandbindingprotein）

與單鏈DNA結(jié)合，阻止其再形成雙鏈狀態(tài)

2、

DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）：消除復(fù)制叉前進(jìn)過(guò)程中產(chǎn)生的正超螺旋，產(chǎn)生負(fù)超螺旋第四十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第四十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第四十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第四節(jié)DNA復(fù)制的半不連續(xù)性（Semi-DiscontinuousReplication）

第四十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘

一、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性

事實(shí)上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DNA能按3‘→5’合成的證據(jù)第四十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

崗奇片段（Okazakifragment）1968

用dT-H3

短時(shí)間來(lái)標(biāo)記大腸桿菌D.S.DNAS.S.DNA

蔗糖密度梯度離心測(cè)定H3-T

放射強(qiáng)度得到許多長(zhǎng)度為1kb左右的DNA片段第四十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五先導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)復(fù)制的后隨鏈按Okazaki片段不連續(xù)復(fù)制

先導(dǎo)鏈（leadingstrand）：DNA復(fù)制時(shí)，與復(fù)制叉向前移動(dòng)的方向一致，以3’→5’鏈為模板，按

5’→3’方向連續(xù)合成的一條鏈

后隨鏈（laggingstrand）：岡崎片段(Okazakifragment):DNA復(fù)制不連續(xù)合成鏈中形成的短DNA片段第四十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五后隨鏈的片段合成需要一個(gè)周期性的起始信號(hào)

二、引物（Primer）和引發(fā)酶（Primase）DNApolymerase只能使DNA從引物的3’端延伸DNA復(fù)制如何起始？？？

RNA可能提供了DNA復(fù)制的3’端1、實(shí)驗(yàn)證據(jù)Ⅰ：M13phage的DNA復(fù)制顯示出對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制劑

的敏感性第四十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五E.coli[Rifs]

RNApol[RifS]+M13E.coliM13+S.S.DNAvirus+RF無(wú)M13RFRifalmpinM13Rifalmpin有M13RFRifalmpin

是E.coliRNApolymerase

的抑制劑

第五十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五M13RF的形成需要RNApolymerase發(fā)動(dòng)合成一段RNA分子作為引物（RNA提供復(fù)制的3‘端）RF啟動(dòng)后，Rifalmpin

的抑制無(wú)效結(jié)論（Conclusion）：第五十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、實(shí)驗(yàn)證據(jù)Ⅱ：Reiji等的實(shí)驗(yàn)證據(jù)－－每一岡崎片段都產(chǎn)生一個(gè)RNA－DNA接頭第五十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五3、后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：

?細(xì)菌中先導(dǎo)鏈的合成受Rifalmpin的抑制

?后隨鏈的合成不受Rifalmpin限制（1）原因：?先導(dǎo)鏈的起始需要RNApol的轉(zhuǎn)錄激活?而后隨鏈的起始由引發(fā)酶合成引物，而引發(fā)酶不受Rifalmpin的抑制第五十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活

(transcriptionalactivation）：

DNA復(fù)制起始時(shí)通過(guò)RNApolymerse的轉(zhuǎn)錄過(guò)程而解開(kāi)局部的雙鏈

轉(zhuǎn)錄激活時(shí)產(chǎn)生的RNA能否作為引物目前尚未得出普遍結(jié)論P(yáng)119頁(yè)第五十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第五十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）RNApol(RNApolymerase)[RifS]（2）dnaG(primase)[RifR]

組裝成引發(fā)體

完成對(duì)后隨鏈（先導(dǎo)鏈）引物的合成

（3）完成10±NtRNA引物合成后

DNApolII進(jìn)行DNA鏈的延伸

DNApolⅠLigase主要實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始較先導(dǎo)鏈的啟動(dòng)落后一個(gè)Okazaki片斷4、總結(jié)：第五十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五RNAprimedDNAreplication第五十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五RemovalofRNAprimersandfillingofgaps第五十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五復(fù)制叉如何誕生？有機(jī)體選擇RNA作為引物的可能原因

最終避免由于最初幾個(gè)核苷酸的復(fù)制錯(cuò)誤導(dǎo)致的致死突變!!第五十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五后隨鏈上所包含的事件？

三、后隨鏈的合成及前體片段的連接第六十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

引發(fā)體（包括引發(fā)酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase第六十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第五節(jié)原核生物DNA復(fù)制

(DNAreplicationinProkaryote)

第六十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

一、DNA復(fù)制機(jī)構(gòu)的研究

利用突變表型來(lái)考察基因的功能

但只能利用條件型突變溫度敏感突變體

材料:E.coli或噬菌體第六十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第六十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第六十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

二、DNA復(fù)制的起始

起始方式：

a、從頭起始（denovoinitiation）:

θ復(fù)制、D環(huán)復(fù)制、線(xiàn)狀DNA的復(fù)制

b、共價(jià)延伸（covalentextesion）

滾環(huán)復(fù)制第六十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）OriCinE.colichromosomalDNA

1、oriC與E.coli復(fù)制的起始（從頭起始）?四個(gè)9bp的重復(fù)序列

dnaA結(jié)合位點(diǎn)?三個(gè)13bp的重復(fù)序列第六十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）簡(jiǎn)單起始過(guò)程a、涉及主要酶系：

DnaA（復(fù)制起始）、RNApol是必不可少的，此外涉及到DnaB（解旋酶）、DnaC（引發(fā)體組分）、Hu蛋白、

Gyrase、SSB、DnaG（引物酶）、Top?和DNApolШ全酶第六十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五b、簡(jiǎn)單步驟：

*轉(zhuǎn)錄激活*DnaA識(shí)別并結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)，DnaB－DnaC六聚體與oriC形成預(yù)引發(fā)體

*

DnaG加入形成引發(fā)體（oriC引發(fā)體），合成引物RNA*引物合成后，DNApol組裝到引發(fā)的RNA上，完成復(fù)制體的組裝第六十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五DnaASSB13bprepeats涉及轉(zhuǎn)錄激活第七十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（3）E.coli細(xì)胞加倍時(shí)間與復(fù)制起始加倍時(shí)間37℃<20min～10h復(fù)制時(shí)間：40min左右（850核苷酸／秒）分裂過(guò)程中其它事件約需20min（組分、隔膜）因此－－加倍時(shí)間少于60min的細(xì)胞兩輪復(fù)制有共用時(shí)間第七十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、共價(jià)延伸方式（covalenceelongation）

ФX174的若干正鏈的合成起始－－滾環(huán)復(fù)制過(guò)程第七十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第七十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

三、延伸過(guò)程

進(jìn)入的標(biāo)志：DNApolШ把第一個(gè)核苷酸加到引物的3’－OH端

（一）后隨鏈合成的起始（前體片段的起始）后隨鏈的第一個(gè)岡崎片段起始于先導(dǎo)鏈進(jìn)入延伸之后

Φx174phage后隨鏈的起始（負(fù)鏈合成、不連續(xù)合成）P117頁(yè)

第七十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

Φx型引發(fā)體的組裝以PriA識(shí)別引發(fā)體組裝位點(diǎn)（primosomeassemblysitepas）開(kāi)始，首先形成預(yù)引發(fā)體預(yù)引發(fā)體與引物酶結(jié)合形成了引發(fā)體Φx型引發(fā)體或其部分組分可沿單鏈

DNA移動(dòng)到每一個(gè)岡崎片段的起點(diǎn)PriA提供引發(fā)體移動(dòng)的動(dòng)力第七十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體（引發(fā)體）必須快速?gòu)囊粋€(gè)岡崎片段移到另一岡崎片段InlaggingStrand上多酶系統(tǒng)必須完成多次反復(fù)的啟動(dòng)與擴(kuò)展

E.coli

啟動(dòng)2000—4000次的岡崎片段復(fù)制第七十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

（二）Φx174DNA的復(fù)制

a、SS→RF，

即以（＋）鏈為模板（－）鏈的合成

Φx型引發(fā)體起始后，由DNApolⅢ、Ⅰ和連接酶等協(xié)同合成（后隨鏈的起始過(guò)程）b、多拷貝RF的合成（滾環(huán)復(fù)制）

（先導(dǎo)鏈的合成過(guò)程、后隨鏈合成）c、后代單鏈（SS）DNA的合成,即以RF的(－)鏈為模板，合成(+)鏈，先導(dǎo)鏈的合成（DNA復(fù)制過(guò)程是上一過(guò)程的一部分）第七十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第七十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

A蛋白（gpA）：

?

Φx174基因A的產(chǎn)物

?結(jié)合到RFⅠDNA的復(fù)制原點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)（引發(fā)體的幫助）

?誘導(dǎo)相鄰的識(shí)別位點(diǎn)的熔解(富含A/T)?其核酸內(nèi)切酶活力切割（＋）鏈的4305與4306堿基的酯鍵，并共價(jià)連接于5’端（A），另一端為自由的

3’－OH（G）Rep蛋白－－解旋酶

第七十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第八十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五復(fù)制體第八十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五復(fù)制叉處的復(fù)制體

（三）前導(dǎo)鏈和后隨鏈的協(xié)同合成聚合酶Ш全酶前導(dǎo)鏈后隨鏈螺旋酶引發(fā)體引物引發(fā)酶活性中心一活性中心二PriA清除SSB提供引發(fā)體移動(dòng)動(dòng)力極性3‘→5’第八十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五一分子的DNApolIII.協(xié)同合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈第八十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

四、復(fù)制終止

1、環(huán)形DNA復(fù)制的終止

a、終止序列

E.coli有兩個(gè)終止區(qū)域，分別結(jié)合專(zhuān)一性的終止蛋白

序列一：terEterDterA

序列二：terFterBterC

每個(gè)區(qū)域只對(duì)一個(gè)方向的復(fù)制叉起作用第八十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第八十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

b、專(zhuān)一性終止蛋白

E.coli中由tusgene

編碼

（terminusutilizationsubstance）

通過(guò)抑制DNA解旋酶而發(fā)揮終止作用每次復(fù)制時(shí)只使用一個(gè)終止位點(diǎn)ter第八十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五第八十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、細(xì)菌(E.coli)DNA每個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次第八十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

3、線(xiàn)性DNA的末端復(fù)制的問(wèn)題第八十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五?環(huán)狀DNA復(fù)制是否存在這樣的問(wèn)題,為什么?第九十頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（1）線(xiàn)狀DNA的復(fù)制5’末端短縮的解決模式

a、從開(kāi)始就采取環(huán)化的形式－－－λ噬菌體

b、象T7噬菌體一樣采取連環(huán)分子的形式

利用自身線(xiàn)性DNA末端的重復(fù)序列－－通過(guò)末端互補(bǔ)形成連環(huán)分子

c、最直接的辦法－－－引入蛋白質(zhì)直接從末端起始復(fù)制如－－－腺病毒－2、phageΦ29、脊髓灰質(zhì)炎病毒

d、痘病病毒的末端由發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接

復(fù)制完成后錯(cuò)切連接第九十一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五??二聚體3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHT7噬菌體的末端復(fù)制專(zhuān)一性核酸內(nèi)切酶第九十二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

腺病毒（Adnovirus-2）DNA的復(fù)制

35937bp

TP

C

G

IR103-162

IR;包括50bp的復(fù)制原點(diǎn)、富含A/T、有一個(gè)高度保守的G／C對(duì)pTP;末端蛋白的前體

80kd→

TP55kdSSB;單鏈DNA結(jié)合蛋白

72kdAd2DNApolymerase;

140kd

第九十三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五復(fù)制起始復(fù)合體引發(fā)復(fù)制（不需引物）

避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMP

CG●過(guò)程

SSB+ATPDNA末端解鏈

TPpTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OH第九十四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五腺病毒DNA復(fù)制起始G第九十五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五IRIR長(zhǎng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)

痘病病毒末端復(fù)制的解決方式－－－－P122第九十六頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

五、復(fù)制忠實(shí)性的保證

1、DNApol的3’5’外切酶活性

(exonucleaseactivity)

2、DNApol只能從引物的3’

端延伸DNA

（需要RNA引物）

a、堿基配對(duì)協(xié)同性導(dǎo)致最初幾個(gè)堿基錯(cuò)配率高，且不易校正

b、RNA引物最終被降解而避免錯(cuò)誤

3、后隨鏈的不連續(xù)合成因其有利于錯(cuò)配堿基的校正第九十七頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

3.6.真核生物DNA的復(fù)制(DNAreplicationinEukaryote)

第九十八頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

1、復(fù)制概況

a、多個(gè)復(fù)制元（multiplereplicon

），雙向復(fù)制

b、復(fù)制元相對(duì)較小(13-900kb),

復(fù)制速度較慢,大約

500~5000bp/min

（3000bp/min）

岡崎片段100～200NTc、復(fù)制終止通過(guò)復(fù)制叉的相遇而終止第九十九頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五multiplereplicon

例；果蠅5000replicons平均40Kb（酵母）哺乳動(dòng)物平均100Kb第一百頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

2、真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五種

位置核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)線(xiàn)粒體

合成

與引發(fā)修復(fù)合成合成,修復(fù)復(fù)制功能酶結(jié)合前導(dǎo)鏈

后隨鏈3’－5’校NONOYesYesYes正活性

α

β

δ

ε

γ第一百零一頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

真核生物DNA復(fù)制的引發(fā)酶●DNApolα+primase形成緊密的復(fù)合物

6-9NtRNAasprimer

●引發(fā)酶（primase）：50-60kd

●作用方式為陣發(fā)性的，每次作用拷貝6～15個(gè)核苷酸

●既能利用rNTP，又能利用dNTP

●SV40體外DNA復(fù)制情況分析

第一百零二頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

ε

δ第一百零三頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

3、真核生物的復(fù)制起始受許可因子的控制4、逆轉(zhuǎn)錄酶自學(xué)（P127）第一百零四頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五

5、真核生物染色體DNA末端補(bǔ)齊模式

(1)端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含G鏈)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(富含C鏈)

第一百零五頁(yè)，共一百一十三頁(yè)，編輯于2023年，星期五（2）端粒酶（

Telomerase）1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling四膜蟲(chóng)端粒酶

（telomerase）將T2G4

末端重復(fù)延伸游撲蟲(chóng)

Telomerase=RNACAAAACCCC

鏈+

末端結(jié)合蛋白（TBP）端粒酶－－－逆轉(zhuǎn)錄酶a、核蛋白（ribonucleoproteinRNP）b、含