分子診斷基因治療

分子診斷基因治療第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五一概述：病理學(xué)在經(jīng)歷了幾個階段器官病理學(xué)組織病理學(xué)細胞病理學(xué)免疫病理學(xué)第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五分子病理學(xué)：應(yīng)用細胞分子生物學(xué)的理論和技術(shù)方法，對人類疾病發(fā)生發(fā)展、發(fā)病原因、機制、疾病的形態(tài)變化從分子or基因水平加以認(rèn)識。病理學(xué)診斷也由以形態(tài)學(xué)觀察為基礎(chǔ)逐步進入分子水平，既分子診斷—以探查基因的變化來達到診斷疾病的目的。第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五分子診斷的特點：

靈敏度高：基因雖然微量，難以檢測，但目前已有使用基因or其片段高度擴增的PCR技術(shù)，以及應(yīng)用高靈敏度的基因探針，即可探測。

特異性強：基因診斷檢測的目標(biāo)是基因，不同的基因的堿基序列各不相同，檢測基因的分子生物學(xué)方法亦是高度特異性的。

適用范圍廣。第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五目前主要應(yīng)用于：人類遺傳病的基因診斷or產(chǎn)前診斷；腫瘤；感染性疾病病原體（細菌，病毒）；多基因病；組織器官移植配型；法醫(yī)學(xué)—個人識別（個人特異性的DNA指紋圖）；親子鑒定。其中腫瘤的分子診斷涉及到，多種惡性腫瘤、癌前病變。診斷的基因涉及多種癌基因，抑癌基因及相關(guān)基因。第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二分子診斷在腫瘤研究中的意義和應(yīng)用1腫瘤易感基因的檢測：腫瘤分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤的發(fā)生具有遺傳學(xué)基礎(chǔ)，故腫瘤遺傳相關(guān)的易感基因檢測對于腫瘤高危人群的篩測具有實用價值。已明確的腫瘤易感基因及相關(guān)腫瘤有：

第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五Rb1-視網(wǎng)膜母細胞瘤，為抑癌基因，定位于13q14.1

染色體,基因產(chǎn)物位于細胞核。APC-家族性腺瘤性息肉病，該基因定位于5q21染色體,

基因產(chǎn)物位于細胞膜，功能不清。WT1-腎母細胞瘤，該基因定位于11p13染色體,基因產(chǎn)物位于細胞核。BRCA1-乳腺癌，卵巢癌等，該基因定位于17q21染色體,

基因產(chǎn)物位于細胞核，為核內(nèi)磷酸化蛋白與激素信號傳導(dǎo)有關(guān)。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五抑癌基因與相關(guān)腫瘤抑癌染色體基因產(chǎn)遺傳性腫瘤散發(fā)性腫瘤基因定位物定位Rb13q14核內(nèi)視網(wǎng)膜母細胞瘤視網(wǎng)膜母細胞瘤膀胱癌乳癌食道癌肺癌P5317p13核內(nèi)膀胱癌乳腺癌食道癌肺癌肝癌卵巢癌淋巴瘤DCC18q12胞膜結(jié)腸癌直腸癌APC5q21胞漿家族性多發(fā)性腺瘤結(jié)腸癌直腸癌胃癌胰腺癌WT111p13核內(nèi)Wilm’s瘤Wilm’s瘤P169q21核內(nèi)黑色素瘤黑色素瘤膀胱癌乳腺癌肺癌腎癌卵巢癌BRCA117q21胞漿乳腺癌卵巢癌乳腺癌卵巢癌結(jié)腸癌直腸癌前列腺癌第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2腫瘤的分類：對BCR區(qū)基因重排的檢測，可對慢性粒細胞性白學(xué)病進行診斷，該基因定位于22q染色體,該基因稱為斷裂點群區(qū)域基因，9q上的AB1基因與22q34.36區(qū)域基因序列相融合。對N-myc和C-myc的擴增和表達檢測，對鑒別神經(jīng)母細胞瘤和神經(jīng)上皮瘤具有應(yīng)用價值。N-myc明顯擴增和過度表達--神經(jīng)母細胞瘤。C-myc的擴增和過度表達--神經(jīng)上皮細胞瘤。

第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3腫瘤的早期診斷：

K-Ras基因突變，在胰腺癌，結(jié)腸癌，肺癌中發(fā)生率較高，其突變點在第12編碼子最常見。應(yīng)用針吸活檢檢測胰腺癌中第12編碼子突變，檢出率達100%。

K-Ras基因編碼鳥苷酸結(jié)合蛋白，與GTPase結(jié)合。其突變降低了Ras蛋白與GTPase的結(jié)合能力，導(dǎo)致Ras蛋白與GTP的持續(xù)結(jié)合，從而促進細胞的生長作用。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五4腫瘤的預(yù)后判斷：腫瘤相關(guān)基因的突變，擴增及過表達等改變常與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。如，P53基因突變與乳腺癌，肝癌，結(jié)腸癌等多種腫瘤預(yù)后相關(guān)。P53基因位于17p13，基因產(chǎn)物定位于細胞核，編碼393個氨基酸組成的53KD的核內(nèi)磷酸化蛋白，具有蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合的功能，p53是細胞周期中負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細胞周期的調(diào)控，DNA修復(fù)，細胞分化，細胞凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)。第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23的表達水平與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。

Nm23位于17q22，基因產(chǎn)物定位于細胞漿，基因功能不太清楚。CerbB-2基因的過表達與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。上皮生長因子受體，為磷酸化蛋白。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五5腫瘤的預(yù)見性治療：腫瘤的發(fā)生是多基因，多步驟，多階段的過程。在腫瘤發(fā)生，發(fā)展的不同時期，可能涉及不同的基因和不同的變化形式，與腫瘤臨床治療敏感性密切關(guān)聯(lián)。如能在分子水平上對腫瘤基因變化提供指標(biāo)，則對腫瘤的預(yù)見性治療具有指導(dǎo)意義。如90%的胰腺癌，50%的結(jié)腸癌，30%的非小細胞肺癌存在Ras基因的激活，對放療具有抵抗性，如能從基因水平上改變異常的基因狀態(tài)，則可提高放療敏感性。第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五起動階段促進階段進展階段↓↓↓正常胃粘膜→萎縮性胃炎→腸化→異型增生→原位癌→轉(zhuǎn)移癌↑↑↑基因點突變基因擴增基因缺失or過量表達or重排

Ras,P53erbB2,EGFRApc,P53,P16,Rb,nm23第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五6腫瘤的預(yù)后監(jiān)測：如用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)可使白血病細胞檢出率達到1/106左右，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測周圍血中的腫瘤細胞，可提高對腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)測的準(zhǔn)確性。分子診斷在腫瘤的監(jiān)測方面具有重要意義。腫瘤的分子診斷主要集中于對癌基因，抑癌基因及相關(guān)基因的檢測，分別在蛋白質(zhì)，RNA和DNA水平進行判斷。

第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三腫瘤基因過表達及其檢測

1基因過表達的形式：癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵因素，癌基因的激活有多種表現(xiàn)形式，其中基因產(chǎn)物過表達為形式之一。癌基因一般為單拷貝基因，在腫瘤細胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復(fù)制過程中形成多拷貝，這種基因的擴增，使得基因過表達，表現(xiàn)為mRNA和蛋白質(zhì)量的增加。抑癌基因在正常情況下維持細胞的正常周期。P53其野生型基因產(chǎn)物半衰期短而不易檢測到，但突變后其產(chǎn)物半衰期延長。第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五人類腫瘤中的癌基因擴增癌基因腫瘤及擴增百分比（%）C-myc乳腺癌(15-23),結(jié)腸癌(3-6)

肺鱗狀細胞癌(12-25)N-myc神經(jīng)母細胞瘤(10-31)c-myc,N-mycorL-myc肺小細胞癌(11-23)C-mycorL-myc肺腺癌(2-11)ErbB-2乳腺癌(16-33),

胃癌和食道癌(5-13),

卵巢癌(20-33)K-ras乳腺癌(3),卵巢癌(4-8),肺癌(4)第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五幾種常見腫瘤癌基因的擴增率基因腫瘤類型擴增率(%)基因腫瘤類型擴增率(%)C-erbB-2乳腺癌16-33N-Myc肺腺癌2-11

胃，食道癌5-13K-Ras乳腺癌3-10

卵巢癌20-33胰腺癌45

膽囊癌45-58卵巢癌8-8

肝癌25-45膽囊癌30-61C-Myc乳腺癌25-30N-Ras肝癌24

結(jié)，直腸癌3-6

膽囊癌40-60

肝癌25-42

肺鱗癌15-25第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2基因過表達的檢測：1）

表達產(chǎn)物的檢測：癌基因，抑癌基因其蛋白產(chǎn)物的過表達可以應(yīng)用相應(yīng)的抗體，通過免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）方法檢測腫瘤組織中蛋白產(chǎn)物，or蛋白印跡(WesternBlot)以及酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測腫瘤細胞or血清中的蛋白產(chǎn)物。免疫組化：在組織切片上進行。特點-是保持組織結(jié)構(gòu)的條件下原位進行分析。

ELISA是在細胞懸液中進行。第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五Westernblot

既可對組織細胞進行分析，也可對釋放至血液中的蛋白質(zhì)進行檢測。流式細胞儀（Flowcytometry）新一代測定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法,首先標(biāo)記熒光于相應(yīng)的抗體蛋白，與含有特異性抗原的細胞結(jié)合后，用流式細胞儀對不同熒光信號的細胞進行分類、測試。在已報道的研究結(jié)果中，許多腫瘤都存在其相關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物過表達。如乳腺癌—C-erbB-2表達，陽性率50%，P53為50%，并與其組織學(xué)類型、浸潤、轉(zhuǎn)移傾向和預(yù)后有關(guān)。P53基因產(chǎn)物在大多數(shù)腫瘤中都有過表達，包括胃癌，直腸癌，肺癌，食道癌，肝癌，卵巢癌等。第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2）基因擴增的檢測：腫瘤基因的擴增可產(chǎn)生過量的表達蛋白，此外表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)的增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的增加，可通過分子診斷方法進行檢測。經(jīng)典的方法：

核酸分子雜交—原位雜交（Insituhybridization,ISH）

Southernblot(DNA雜交)，Northernblot(RNA雜交)，原位PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR。第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五核酸分子雜交：是檢測核酸分子間序列同源性的一種技術(shù)。不同來源的核酸單鏈只要彼此間有一定的互補順序，即可按堿基配對規(guī)則以氫鍵相結(jié)合。通常是先對一種核酸進行標(biāo)記（如放射性同位素or熒光素、生物素等）作為探針，去探測另一核酸序列。先經(jīng)過變性使DNA雙鏈分開成單鏈，再進行雜交，可以是DNA-DNA,RNA-RNA,orDNA-RNA之間進行。第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五原位雜交：用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。用原位雜交技術(shù)檢測腫瘤細胞內(nèi)癌基因的mRNA可檢出激活的癌基因。用不同種類的癌基因探針檢測同一種癌組織內(nèi)mRNA可以明確有哪些基因被激活。第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五Southernblot：

1975年由Southern提出并以其名字命名的一種DNA特定序列定位技術(shù)。基本原理—從組織細胞中提取基因組DNA，用一種or多種限制性內(nèi)切酶酶切，通過電泳，轉(zhuǎn)膜，原位變性固定于固相支持物（硝酸纖維濾膜or尼龍膜），用已標(biāo)記的特異性DNAorRNA探針與固定有DNA的固相支持物雜交，經(jīng)放射自顯影or化學(xué)發(fā)光自顯影，對顯影條帶進行分析?？梢源_定在眾多酶解產(chǎn)物中某一特定序列DNA片段的位置和大小。最常見的研究對象為基因組DNA，也可以用于質(zhì)粒DNA的片段分析。第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五Northernblot：

1977年Alwine等提出的一種類似于Southern的方法，主要用于分析mRNA?；境绦颉崛〗M織細胞中的RNA--電泳，原位轉(zhuǎn)移至固相支持物上--雜交--放射自顯影or化學(xué)發(fā)光自顯影—結(jié)果分析。以顯示目標(biāo)RNA所存在的位置，含量。第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五PCR—聚合酶鏈反應(yīng)：

1983年美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，1985年公開報道，該技術(shù)的發(fā)明在生命科學(xué)中掀起了一場革命。其實質(zhì)就是一種在體外經(jīng)酶促反應(yīng)將特定的DNA序列進行高效，快速擴增的技術(shù)。反應(yīng)體系：

Taq酶（屬DNA聚合酶）。合成的DNA引物。

Mg2＋,緩沖液—提供反應(yīng)合適的酸堿度。三磷酸脫氧核苷酸dNTP。第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五原位PCR：

1992年建立。在組織細胞原位進行DNA擴增的定位，定性研究方法。PCR擴增技術(shù)＋原位雜交技術(shù)相結(jié)合，通過PCR技術(shù)對靶核苷酸序列在染色體上or組織細胞內(nèi)進行原位擴增，使基因拷貝數(shù)放大，再通過原位雜交方法檢測，以達到對靶核苷酸進行定位，定性，定量分析。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：為RNA的快速體外擴增的一種技術(shù)。RNA的擴增需將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶來完成，首先合成的第一條鏈cDNA，以cDNA作為模板，再用特異的引物進行PCR擴增。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五四基因突變及其檢測基因突變的結(jié)果使癌基因激活或抑癌基因失活，細胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生。

腫瘤細胞—可檢測到突變的基因。

癌前病變or癌前狀態(tài)組織細胞—存在不同形式和不同程度的基因突變。第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1基因突變的形式：

點突變—指基因在特定位置發(fā)生一個核苷酸的改變，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的一個氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和生物學(xué)功能。研究表明，大部分的腫瘤幾乎都存在相應(yīng)基因的點突變?nèi)绶伟螂装?，結(jié)腸癌，胃癌，乳腺癌等存在H-Ras,K-Ras,N-Ras的第12，13，61編碼子的點突變。

P53,P16,P15等幾種抑癌基因也在多種腫瘤中存在點突變。第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五人類腫瘤中的Ras基因突變Ras突變百分比（%）活化的Ras基因肺腺癌30K-Ras結(jié)腸腺癌50K-Ras胰腺癌90K-Ras膽管腺癌90K-Ras膀胱癌6H-Ras乳腺癌＜5K-Ras宮頸癌25H-Ras甲狀腺癌＞60H-Ras,K-Ras,N-Ras黑色素瘤20N-Ras精原細胞瘤40K-Ras,N-Ras第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五人類腫瘤中P53基因突變熱點和頻率腫瘤類型突變頻率突變熱點(編碼子)肺癌56157，248，273結(jié)腸癌50175，245，248，273食道癌45不確定卵巢癌44273胰腺癌44273皮膚癌44248，278胃癌41不確定第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五人類腫瘤中P53基因突變熱點和頻率腫瘤類型突變頻率突變熱點(編碼子)頭頸部鱗癌37248膀胱癌34280肝細胞癌45249乳腺癌22175，248，273甲狀腺癌13248，273宮頸癌7273第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五基因缺失—指基因片段的缺失（Geneloses），缺失的范圍差異較大，可以是1-2個堿基，也可以是一個片段。是另一種主要的突變形式。常見的缺失位點如乳腺癌的3p7q11p13q16q17p等，結(jié)腸癌的5q17p18q等?；蚱蔚娜笔Э墒乖摶蚣せ睢⑥D(zhuǎn)錄異常，使基因正常的生物學(xué)功能喪失?；蛉笔悄[瘤形成的原因還是細胞惡性轉(zhuǎn)化后的結(jié)果，仍值得深入探討。第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五基因易位或重排—某一基因在腫瘤細胞中從染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個位置上稱易位or重排（Genetranslocationandrearrangement）。易位與重排易使癌基因被激活，或使抑癌基因失活，從而使細胞惡變。細胞癌基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到促進子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時，可使細胞癌基因與正常的抑制子分開而被置于活化DNA序列的控制之下，而使其活化。Burkitt淋巴瘤c-myc基因8q24易位于2p11。慢性or急性粒細胞白血病，急性淋巴細胞白血病，癌基因Ab1從9號染色體易位于22號染色體。9q34—22q11。Ewing肉瘤，SiS基因從22號染色體易位于11號染色體。SiS基因編碼生長因子類癌基因，其產(chǎn)物為PDGF-血小板生長因子亞單位，作用于PDGF受體，使細胞增殖。第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五幾種常見腫瘤的染色體易位常見腫瘤染色體易位涉及的癌基因小無裂細胞淋巴瘤t(8;14)(q24;q32)c-Myc濾泡性淋巴瘤t(14;18)(q32;q21)Bcl-2Burkitt淋巴瘤t(8;2)(q24;p11)c-Myct(8;14)(q24;q23)c-Myct(8;22)(q24;q11)c-MycEwing肉瘤t(11;22)(q24;q12)c-Sis透明細胞肉瘤