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文檔簡介
白念珠菌口腔黏膜感染小鼠模型的建立及評估李成蹊;鄭林霞;左露露;黃云生;陳圣琰;魏昕【摘要】ObjectiveToestablishamurineoralmucosalcandidiasismodel,observeoralmucosalinfectionandexaminethecorre-spondingsystemicinfectiondynamically,andtoanalyzethechangesoftheinfection.MethodsImmunosuppressedmicewereinocu-latedwithC.albicansinfectionusingtheoralswabs.Lesionsinthemurinetonguewereobservedusingmacroscopicobservation.Thevi-ablecellsoftheC.albicansintheoralcavitywerecalculatedandthehistologicalstudyofthemurinetongueswasanalyzedtodetermineC.albicansinfectionsoftheoralmucosal.Weightandfungalburdensinthekidney,liverandfecesfromthedescendingcolonwereex-aminedtoassesstheseverityofthesystemicinfections.Theaboveindicatorsintheinfectedmicewereexaminedandrecordedforaweekafterinoculation.Intheblankgroupimmunosuppressedmicewereswabbedwithsaline.Results①ThenumberofviableC.albi-canscellsintheoralcavitywaslowonthe1stdayafterinoculation,thenrapidlygrewandtendedtobestablebetweentherangeof106-107CFU/mlfromday3today7afterinoculation.Oraltonguelesionshadasimilartrend.Therewasnoobviouspseudomembranousonday1andvisibletonguedorsalpseudomembranouscouldbeseenfromday3today7afterinoculation.?HistopathologicalsectionsstainedbyPASrevealedthatC.albicanshaddevelopedamycelialform,penetratedintothemucosalepitheliumanddestroyedtheepi-theliumwithin3-5daysafterinoculation.Therewerevisibleyeastcellsonthemucosalepitheliumonday7afterinoculation.③Theweightofthemicegraduallydecreasedafterinoculation.Candidacellsthatrecoveredfromfecesgraduallyincreasedandreachedtothehighestlevelonthe5thdayafterinoculation,butinkidneysandlivers,therewerenoviableCandidacells.TheblankgroupwasnotinfectedwithC.albicans.ConclusionInoculatingC.albicansintheoralcavityofmiceusingoralswabscanestablishamurineoralmucosalcandidiasismodel.Theoralcandidiasisoftheinfectedmicehaschangesinaweek.Theappropriatetimeofanimalexperimentsshouldhavebeenchosendependingontheinfectionstatus.%目的建立白念珠菌口腔黏膜感染ICR小鼠模型,動態(tài)觀察口腔黏膜及相應(yīng)的全身感染情況,并對變化情況進(jìn)行初步分析.方法將白念珠菌接種于免疫功能低下小鼠口腔,采用肉目艮觀察口腔舌背病損改變、口腔內(nèi)白念珠菌菌量檢測、組織病理學(xué)等方法評估口腔內(nèi)黏膜感染情況,檢測體重、載菌量(腎、肝、下降結(jié)腸內(nèi)糞便)評估全身感染情況.觀察1周,并記錄數(shù)據(jù).空白對照組為接種生理鹽水的免疫功能低下組.結(jié)果①小鼠接種白念珠菌后第1天口腔白念珠菌菌量較低,隨后迅速增長,3~7d內(nèi)趨于穩(wěn)定,穩(wěn)定于106~107CFU/mL.同時口腔舌背病損也出現(xiàn)類似趨勢,第1天未見明顯偽膜,3~7d內(nèi)可見舌背偽膜存在.②病理切片PAS染色顯示接種后3~5d內(nèi)白念珠菌形成菌絲侵入并破壞上皮,到接種第7天時,黏膜上皮多見酵母細(xì)胞.③小鼠接種白念珠菌后體重逐漸下降.糞便載菌量逐漸上升,第5天達(dá)到最大,但腎、肝無白念珠菌感染.空白組未見白念珠菌感染.結(jié)論通過在ICR小鼠口腔內(nèi)接種白念珠菌可以建立白念珠菌口腔黏膜感染動物模型.接種后白念珠菌感染程度在1周內(nèi)存在變化.動物實驗應(yīng)根據(jù)感染狀況選擇合適的研究時段.【期刊名稱】《口腔醫(yī)學(xué)》【年(卷),期】2018(038)005【總頁數(shù)】5頁(P394-398)【關(guān)鍵詞】白念珠菌;口腔白念珠菌病;黏膜感染;鼠【作者】李成蹊;鄭林霞;左露露;黃云生;陳圣琰;魏昕【作者單位】南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點實驗室,南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,江蘇南京210029;南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點實驗室,南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,江蘇南京210029;南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點實驗室,南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,江蘇南京210029;南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點實驗室,南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,江蘇南京210029;南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點實驗室,南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,江蘇南京210029;南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點實驗室,南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科,江蘇南京210029【正文語種】中文【中圖分類】R780.2白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)是人類口腔、胃腸道和泌尿生殖道常駐條件致病真菌,與口腔念珠菌病相關(guān),其致病通常與個體局部或全身系統(tǒng)性因素有關(guān)。義齒的使用[1]、糖尿?。?]、年齡增高所致的唾液功能減退[3]、廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用[4]、免疫抑制劑長期使用、免疫功能缺陷[5-8]等都會誘發(fā)念珠菌感染。近年來,白念珠菌感染在免疫功能低下或患有人類免疫缺陷病毒的患者中存在增高趨勢。構(gòu)建一種簡便、穩(wěn)定的動物念珠菌感染模型有助于深入了解念珠菌致病的機制,研究口腔念珠菌感染過程中宿主與白念珠菌之間的相互作用,進(jìn)而探索新的抗真菌感染藥物以及治療新方法[9]。目前小鼠念珠菌感染模型種類日益增多,但口腔黏膜感染模型建模較困難,原因是口腔感染具有自限性,正常小鼠白念珠菌口腔感染會被機體免疫清除[10]。本實驗采用潑尼松龍等糖皮質(zhì)激素使小鼠處于免疫功能低下狀態(tài),在此基礎(chǔ)上構(gòu)建口腔黏膜念珠菌感染模型、評價口腔內(nèi)黏膜及全身的感染情況,深入探討小鼠口腔白念珠菌感染的變化特點,為動物實驗選擇合適的研究模型提供理論指導(dǎo)。1材料與方法1.1實驗動物50只SPF級ICR小鼠,雌性,6周齡,體質(zhì)量20-25g,購于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心,隨機分為實驗組與空白組,各25只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本動物實驗已通過南京醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理審查同意。1.2白念珠菌懸液制備白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314,從美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)購置。將-70°C保種的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株置SDA培養(yǎng)基上生長,37C5%CO2培養(yǎng)24h。取單克隆菌株接種于YPD培養(yǎng)液中,30C,180r/min,搖床過夜。將YPD培養(yǎng)液中的菌液3000r/min離心5min,無菌PBS洗滌2次,血細(xì)胞計數(shù)法計數(shù),并用生理鹽水制備成濃度為2x108個/mL的菌懸液。1.3小鼠白念珠菌感染口腔模型構(gòu)建口腔念珠菌病動物實驗?zāi)P蜆?gòu)建方法參考文獻(xiàn)[11-12]。在接種前1d和接種后第3天小鼠肌肉注射10g/L潑尼松龍促使小鼠免疫抑制,同時前1d飲水中加入鹽酸四環(huán)素0.83g/L直至實驗結(jié)束。接種前小鼠大腿肌肉注射50pL2g/L氯丙嗪麻醉,使其鎮(zhèn)靜狀態(tài)持續(xù)約3h。棉拭子浸入2.0x108個/mL的白念珠菌懸液,涂抹接種小鼠整個口腔(包括頰黏膜、舌、軟腭以及口腔其他黏膜表面)1min;空白組同樣進(jìn)行潑尼松龍及四環(huán)素處理,以滅菌生理鹽水涂抹口腔。1.4感染程度評估-般狀況接種后觀察并記錄小鼠皮毛、行為、黏膜、眼睛、體重和死亡情況等表現(xiàn)??谇簧啾巢p觀察及評估在接種后1、3、5、7d隨機選取5只小鼠,脫頸處死后觀察小鼠舌頭,對小鼠舌背表面?zhèn)文っ娣e及厚薄進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分:正常;1分:少量薄偽膜,覆蓋舌表面<20%;2分:薄偽膜,覆蓋舌表面積<90%且>21%;3分:薄偽膜,覆蓋舌表面積>91%;4分:厚偽膜,覆蓋舌表面積>91%??谇话啄钪榫吭u估以菌落形成單位(CFU)表示。無菌棉拭子擦拭小鼠整個口腔(包括頰黏膜、舌頭、軟腭和其他口腔黏膜表面)。棉簽頭部剪掉立即放入含有0.99mLPBS的離心管內(nèi),旋渦振蕩器震蕩1min,進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋,在每個稀釋液取0.1mL接種到沙堡氯霉素培養(yǎng)基中,每個濃度分3個平行板,37°C下培養(yǎng)24h,計數(shù)培養(yǎng)基上生長的菌落CFU并取10的對數(shù),單位CFU/mL。1.4.4組織載菌量測定小鼠下降結(jié)腸收取糞便,同時無菌解剖腎、肝,稱重后分別放入含1mL生理鹽水的組織研磨器中研磨,無菌PBS10倍稀釋,分3份涂布沙堡氯霉素培養(yǎng)基中,37C下培養(yǎng)24h,計數(shù)培養(yǎng)基上生長的菌落并取10的對數(shù),單位CFU/g。1.4.5病理學(xué)分析取小鼠舌頭固定于4%的多聚甲醛中,脫水包埋,切取5pm厚度的組織,進(jìn)行PAS染色,用光學(xué)顯微鏡(200倍放大)觀察白念珠菌感染情況和組織損傷程度。1.5數(shù)據(jù)處理實驗結(jié)束后,小鼠舌背病損評分、口腔白念珠菌菌量、體重、組織載菌量等數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。采用GraphPadPrim5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表形成。2結(jié)果2.1感染小鼠口腔局部狀況變化圖1和圖2A結(jié)果顯示小鼠接種白念珠菌1d后舌背病損及評分((0.9±0.15)分,主要為0分和1分)未見明顯變化,1~2d內(nèi)偽膜迅速出現(xiàn)并增長,3~5d舌背可見厚的偽膜,覆蓋面積超過舌表面的90%((3.4±0.18)分,(3.6±0.21)分,病損評分主要為3分和4分),7d時舌背仍有偽膜存在,但覆蓋面積不足90%((2.8±0.20)分,病損評分多集中在2分和3分)。圖2B可以看到口腔白念菌量從接種1d后(5.32±0.27)CFU/mL開始增長,到5d時達(dá)到最高值(6.78±0.21)CFU/mL,7d時稍有所下降(6.32±0.34)CFU/mL,但3~7d內(nèi)白念珠菌菌量趨于穩(wěn)定于106~107CFU/mL。圖1白念珠菌感染小鼠舌背病損變化情況Fig.1ChangesofwhitepatchesofmurinetongueslesionsafterC.albicansoralinfectionA:感染小鼠舌背病損評分變化;B:小鼠感染后口腔白念珠菌菌量變化A:changesofscoreofC.albicans-inoculatedtongueslesion;B:changesofthenumbersofviableC.albicanscellsintheoralcavityafterC.albicansoralinfection圖2小鼠感染后口腔黏膜局部變化情況Fig.2Oralmucosalchangesofmiceafterinfection2.2感染小鼠系統(tǒng)體征狀況變化小鼠感染1d后出現(xiàn)松毛和行動遲緩的現(xiàn)象,3~5d出現(xiàn)震顫、蜷縮、眼瞼閉合等情況,7d時松毛現(xiàn)象有所緩解。無小鼠死亡。圖3A示小鼠體重整體呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,其中1~3d內(nèi)小鼠體重下降明顯(體重喪失比重11%),3~7d內(nèi)持續(xù)下降,但之后下降減緩,到接種7d時小鼠體重下降約25%。小鼠的糞便載菌量結(jié)果參見圖3B。感染后的糞便載菌量逐日上升,第5天達(dá)到最高,接近107CFU/g,第7天有所下降。與之相反,小鼠腎、肝內(nèi)組織載菌量為0(未顯示),載菌量在7d中并無變化。A:小鼠體重喪失比重變化曲線;B:感染小鼠糞便載菌量變化曲線;A:ratioofbodyweightlossinC.albicansinfectedmice;B:changesofC.albicanscellsrecoveredfromfecesofinfectedmice圖3口腔黏膜感染小鼠系統(tǒng)變化Fig.3Systemchangesoforalmucosalinfectionmice口腔黏膜感染小鼠的組織病理學(xué)分析PAS染色顯示空白對照組小鼠舌背可見絲狀乳頭整齊排列,未見明顯白念珠菌。接種后第1天小鼠舌背病理學(xué)切片可見白念珠菌形成菌絲,多位于舌乳頭表面之間。第3天小鼠舌背菌絲增多,舌乳頭及周圍的上皮細(xì)胞層破壞,菌絲下方上皮可見炎癥細(xì)胞浸潤。第5天可見較厚的菌絲團(tuán)覆蓋,菌絲較長并侵入上皮組織,同時上皮結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重。第7天舌表面菌絲較第5天少,多為酵母細(xì)胞,同時舌乳頭喪失,黏膜上皮開始修復(fù)。參見圖4。A~D:依次為接種后1、3、5、7d;E:空白組小鼠A~D:murinetongues,PASstainingat1d,3d,5dand7dafterinfection;Etheblankgroup圖4白念感染小鼠舌背縱切片顯微圖片(PASx200)Fig,4MicroscopicimageinlongitudinalsectionofdorsalsurfaceoftheC.albicans-infectedtongues(PASx200)4討論假膜型白念珠菌感染動物模型是一種用于口腔念珠菌感染研究的動物模型。由于該小鼠模型具有口腔偽膜等局部臨床體征,模擬了人體偽膜型白念口腔感染。白念珠菌在口腔黏膜感染分為假膜型、紅斑型和增殖型。最后一種形式是慢性的,而前兩種則為急性病損。本研究的動物模型是假膜型念珠菌病,其特點是在頰黏膜、舌頭和軟腭表面的白色偽膜,臨床上常見于局部或全身皮質(zhì)類固醇的患者、人類免疫缺陷病毒陽性患者和其他類型的免疫缺陷的患者[13]。本研究選用ICR小鼠作為動物模型,因為該品系小鼠在國內(nèi)夕卜大多數(shù)動物實驗中廣泛使用,同時易于操作和接種,價格便宜。本研究選用SC5314株作為模型建立的菌株,考慮到該株為標(biāo)準(zhǔn)株,應(yīng)用廣泛,同時可以用于大多數(shù)的基因突變研究,以其為親本構(gòu)建突變株,來評估毒性表型[14-15]。結(jié)合國內(nèi)夕卜文獻(xiàn)和前期實驗,倫理學(xué)對動物的保護(hù),我們選擇了接種1周內(nèi)作為觀察時間。Takakura等[11]選擇皮下注射潑尼松龍建立模型,而本研究選擇潑尼松龍肌注促使免疫下降,相較于皮下注射,肌肉注射發(fā)生作用更迅速,本研究在接種第2天即出現(xiàn)較高的菌量和舌背明顯的偽膜(結(jié)果未顯示),這要早于Takakura的研究結(jié)果。而且相比較于Takakura報道的結(jié)果,本研究中建模后的菌量要更高,舌背偽膜情況更嚴(yán)重,也更明顯,其原因可能是選用的菌種、菌液濃度不同,不同菌種對ICR小鼠口腔黏膜粘附定植能力不一樣。而Okada等[16]研究小鼠模型早期白念珠菌感染,發(fā)現(xiàn)接種白念珠菌48h后小鼠感染情況最重,可能是因為Okada選用的是臨床黏膜感染分離的菌株,毒力更強。羅銀珠等[17]采用帶菌(7x106個/mL)棉簽置于小鼠口腔并停留1.5h的口腔黏膜接種方式,以建立小鼠機會性系統(tǒng)性感染模型,而本研究通過帶菌(2x108個/mL)棉拭子擦拭口腔1min來接種,由于菌液量、菌液濃度和帶菌棉簽停留口腔時間的差異,構(gòu)建的感染模型也存在差異。此外,有文獻(xiàn)使用手術(shù)刀片劃傷或用探針輕劃舌背[18]來建立口腔黏膜感染模型,考慮到此法對小鼠口腔黏膜創(chuàng)傷較大,故本實驗采用棉拭子擦傷口腔黏膜,可以避免對口腔黏膜過大的創(chuàng)傷,同時白念珠菌更容易侵入黏膜組織。本研究選用了舌背病損分?jǐn)?shù)、口腔白念珠菌菌量和組織病理學(xué)來評估對白念珠菌在口腔黏膜的局部感染情況和變化。本實驗研究結(jié)果顯示小鼠接種白念珠菌后舌背病損存在一個由輕到重,再趨于穩(wěn)定的變化趨勢。接種第1天時舌背變化不明顯,未見明顯偽膜出現(xiàn),在第3天舌背可見厚的偽膜,覆蓋面積超過舌表面的90%,隨后偽膜持續(xù)到第7天,雖然第7天偽膜面積不足90%。同樣,口腔白念珠菌菌量也存在類似的變化趨勢,在3~7d口腔黏膜局部的白念珠菌菌量穩(wěn)定于106~107CFU/mL。此外,通過病理切片圖片研究也證實在第3、5天病理組織均可見白念珠菌形成菌絲侵入上皮,上皮組織破壞嚴(yán)重,第7天黏膜上皮可見較多的酵母細(xì)胞。綜合分析說明本研究成功構(gòu)建了一個穩(wěn)定的口腔黏膜白念珠菌感染模型,同時也呈現(xiàn)了一定的變化趨勢,即在第1天時感染不甚嚴(yán)重,但在接種后1~2d內(nèi)感染迅速惡化(結(jié)果未顯示),接種3~5d感染進(jìn)入穩(wěn)定期,而到第7天時感染有所緩解。出現(xiàn)這種感染變化趨勢的原因可能是感染后期藥物效用減退,自身免疫能力逐漸恢復(fù)[19-20],或者小鼠度過了早期急性感染階段,從而對白念珠菌有一定抵抗力[15]。在本研究的白念珠菌感染模型中,口腔中的白念珠菌會被吞咽或隨飲水進(jìn)入消化系統(tǒng),可能會引起腸道白念珠菌感染甚至系統(tǒng)感染。本研究檢測了組織包括腎、肝、下降結(jié)腸內(nèi)載菌量和小鼠體重變化[21],以綜合評估系統(tǒng)感染狀況。研究中發(fā)現(xiàn)小鼠未出現(xiàn)系統(tǒng)感染,而是引起了腸道感染。上述結(jié)果與Takakura等報道結(jié)果[11]相一致。然而,Hisajima等[21]研究結(jié)果顯示腎、肝出現(xiàn)感染,提示系統(tǒng)感染的產(chǎn)生,分析原因可能與接種菌量、真菌菌種和感染接種方式不同有關(guān);有的研究者也認(rèn)為可能因動物個體的免疫機能、黏膜特征或黏膜上皮微生物菌群等差異而有所不同[22]。綜上所述,本實驗在成功建立白念珠菌口腔黏膜感染ICR小鼠模型的情況下,觀察感染情況變化,模擬了人體白念珠菌口腔黏膜感染情況,了解小鼠感染模型的變化規(guī)律,為相關(guān)動物實驗提供理論指導(dǎo)。此外,本研究可以從局部表現(xiàn)和微生物方面為新的抗真菌藥物的療效評價提供參考指標(biāo)。[參考文獻(xiàn)][1] 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