基因工程和人類基因組

基因工程和人類基因組第一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因工程的基本操作程序：制備目的基因；選擇適當(dāng)載體；構(gòu)建重組載體；轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

第二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因的本質(zhì)是DNA遺傳與基因第三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五染色體結(jié)構(gòu)第四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五研究基因的本質(zhì)（一）

有莢膜——致死無莢膜——存活肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）感染實(shí)驗(yàn)一FredrikGriffith,1928第五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五研究基因的本質(zhì)（一）肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）感染實(shí)驗(yàn)二FredrikGriffith,1928第六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控1、DNA結(jié)構(gòu)：華生(Watson)和克里克(Crick)DNA雙螺旋模型（1953）DNA半保留復(fù)制（1953）獲1962年諾貝爾獎(jiǎng)

第七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因工程的基本過程切——從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因切開；接——用DNA連接酶將目的基因片段接到載體分子上，形成重組分子；轉(zhuǎn)——借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中；檢——篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞株。第八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線第九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五制備目的基因的從cDNA文庫或基因組文庫中分離；PCR（PolymeraseChainReaction）法；mRNA差異顯示分離目的基因；化學(xué)合成法；第十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五PCR反應(yīng)PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。第十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五PCR反應(yīng)示意圖第十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五引物引物*引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。*引物設(shè)計(jì)的主要原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。3’5’5’5’PCR技術(shù)基因組第十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五3’3’3’變性、退火延伸變性、退火、延伸3’PCR原理圖第十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五假單胞菌NADH脫氫酶基因

721ACTTCATGCGGGGGCGCAGATACCGGTTGAGGCCGTCGACGATGACGGTCATGCCGGTTT781TCAAGGCGCCATGAATGGCCAGCTGGTGCATGCGATAGAGCGAGGCATAGAACAGCTTGG841CCAGGCGCCCCTCGATGAACAGGCTGCGTGCCGAGGCGCCGCGCATCAGGCTGCCCACGG901CATCGAAGTGCGCCAGCGAGATCAGCGAGCCGCGATCGCGGAAGACGAAATCCTTGAGGG961GCTTGCCGTCCATTGCCGCGCGCAGGTTGTGGTACAACAGGCTGGCTTGCTGATGCGCGG1021CCTGGGCGCCAGGCGGTACGCGCTTGTCGTCGGGTTGCGGGCAGGAGGCGCAGTCGCCCA1081AAGCGAAGATGCGATCGTCGTCGATGCTCTGCAGGGTCTGATGCACCTTGAGCTGATGAT1141TGCGCTCGGTGGAAAGCCCCAGTTCGGACAGAAATGCCGGCGCGCGTATGCCGGCGGCCC1201AGACGTTGAGGTCGGTGGCAATGCGCGTCTCGTCGGCGGTGACGAAACCGTGCTCGTCGG1261CGCAGGTCACGCGGGTGTCGACATGGATCTGCACGCCCAGGCGTTCCAGCTCCTGGTGCA1321CGGCGCGGCTGATGCGCTCGGGCAGCGCCGGCAGGATGCGCGGTGCTGCCTCGATGAGGT1381GGATCTCCAGCTTGCCGCTGTCCATGGCGGTGAACCCGTAGCTGTGCAGCATCTTGGAGG1441CGCCGATCAGTTCGGCGGCCAGCTCGACGCCGGTGGCACCGGCACCGACGAGCCCCACGC1501TCAGGTTGGGATGGGTGCGCCGCTCGGGATCGCTGTACCGCAGGAAGGTGTTGAGCATGT1561CCTGGCGGAAGCTTTCGGCCTGTTGCGGGCTGTCGATGAAGTGGCTGTGCTTGGCCACGC1621CCGGGGTGCCGAAGTCGTTGGAGACGCTGCCCAGCGACATCACCAGGTAATCGTACTCCA1681GCGTGCGCGCCGGCAGGATCACGACGCCGTCGTCGTCGATGATCGGCGCCAGCGTGATGG1741TGCGGTTGTCGCGGTCGAGGTTGCTGAGCGTGCCGCGTTGAAAGCGGTAGCCGTGCGCCT1801TGGAATGCCCCTGGTAGGACACTTCATCGAGGCTGGAATCGAGCACGCCCGTGGCCACTT1861CATGCAGCAGGGGCTTCCAGATGTGCGTGGCGTTGCGGTCGACCAGAACGATCTCGGCGC1921GTTGGCGCTTGCCGAGCTTGCGCCCCAGGCGGGTGACCAGTTCGAGGCCACCTGCGCCTC1981CCCCGACCACCACGATGCGCGGTGTAGACATGATGGACTCCCGAAGAACGAAACATGGAA2041AAAGGGTGTCGCCAGGGTCGGGCATCGCAGCGAAACGCCAAGGTACGAGGCGCCTGGGAA2101GGCGTGTCGTGACGCGGGGGCGCTGGCGCCTGGTGTCGGCGACGTCTGCGTATAGAATAA第十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五PCR擴(kuò)增一個(gè)約1.3kb的基因1904bp1584bp1375bp947bp831bpM1第十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的DNA片段與其連接，而進(jìn)行復(fù)制。

常用載體：質(zhì)粒、病毒；基因工程載體第十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五理想載體的基本條件：可轉(zhuǎn)移性合適的復(fù)制位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)：廣泛、特異選擇標(biāo)志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA第十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子;

具有自我復(fù)制功能;

帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物;

經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn);質(zhì)粒第十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第二十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

不同的DNA分子間發(fā)生共價(jià)連接形成重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段基因重組第二十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第二十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定堿基序列第二十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶目的基因與載體的連接第二十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五重組質(zhì)粒的酶切分析4268bp3530bp1584bp1375bp947bpM123

第二十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

通過物理，化學(xué)或生物的方法將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞第二十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組載體轉(zhuǎn)入細(xì)菌重組載體CaCl2處理第二十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五?-半乳糖苷酶法篩選轉(zhuǎn)化子第二十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五白色菌落提示有外源基因插入第二十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五抗Amp質(zhì)粒宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基第三十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五含重組質(zhì)粒大腸桿菌的蛋白質(zhì)SDS電泳圖譜

87654321M——94kDa——67kDa——43kDa——30kDa——20kDa第三十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的構(gòu)建與生產(chǎn)第三十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五分子篩親和柱離子交換抗原抗體目的蛋白目的蛋白的分離純化第三十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因載體目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主細(xì)胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學(xué)方法目的基因的表達(dá)第三十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五1、基礎(chǔ)理論研究：基因的結(jié)構(gòu)與功能?；虻娜斯ざc(diǎn)突變。人類基因組計(jì)劃基因工程的應(yīng)用第三十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五疾病的診斷：疾病的預(yù)防：基因工程疫苗。疾病的治療：基因工程藥物、基因治療。2、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：第三十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五基因工程方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物第三十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五3、植物基因工程技術(shù)及應(yīng)用植物基因工程的受體是植物細(xì)胞，主要在作物抗病蟲害、抗逆性、提高品質(zhì)、提高產(chǎn)量、醫(yī)藥等方面應(yīng)用。至1998年4月，世界各國批準(zhǔn)進(jìn)行的大田實(shí)驗(yàn)已達(dá)4387項(xiàng)。第三十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五植物基因工程的優(yōu)點(diǎn)可以賦予植物一些通過其它途徑幾乎不可能獲得的新性狀?？梢愿心康牡母牧贾参镄誀??？梢钥s短培育新品系的周期。增產(chǎn)：使作物產(chǎn)量提高5%～15%；

不用或少用農(nóng)藥：第三十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)基因植物研究進(jìn)展自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草、馬鈴薯以來，短短十余年間，植物基因工程的研究和開發(fā)進(jìn)展十分迅速。國際上獲得轉(zhuǎn)基因植株的植物已達(dá)100種以上，包括水稻、玉米、馬鈴薯等作物；棉花、大豆、油菜、亞麻、向日葵等經(jīng)濟(jì)作物；番茄、黃瓜、芥菜、甘藍(lán)、花椰菜、胡蘿卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三葉草等牧草；蘋果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牽牛、菊花、香石竹、伽藍(lán)菜等花卉；以及楊樹等造林樹種。應(yīng)該說轉(zhuǎn)基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性進(jìn)展。第四十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五我國的轉(zhuǎn)基因植物1996年我國投入研究和開發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物僅為47種、涉及各類基因103個(gè)。目前，我國正在研究和開發(fā)的各種生物物種已超過100種，涉及動(dòng)物、植物、微生物基因達(dá)200多個(gè)，若干作物品種已具備了產(chǎn)業(yè)化條件。就整體研究水平而言，我國在發(fā)展中國家處于領(lǐng)先地位，一些領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)入國際先進(jìn)行列。我國是世界上繼美國之后第二個(gè)擁有轉(zhuǎn)基因抗蟲棉自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國家。2004年我國的生物技術(shù)棉花種植面積已達(dá)到370萬公頃。由于節(jié)水、抗蟲、節(jié)約勞動(dòng)力的投入，每年為農(nóng)民增收50億元人民幣。我國的彩棉產(chǎn)量已占到世界彩棉生產(chǎn)總量的1/3，成為全球最大的彩棉生產(chǎn)國；第四十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五2全球轉(zhuǎn)基因作物播種面積增長12%第四十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五耐貯藏西紅柿通過反義RNA技術(shù)，阻斷果實(shí)成熟時(shí)乙烯的生成，延長果實(shí)的貯藏期。第四十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五動(dòng)物基因工程培養(yǎng)出了包括豬、牛、羊、馬、雞、魚等多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，涉及的基因有生長激素基因、抗凍基因、抗病毒基因等。第四十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)第四十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五生物反應(yīng)器利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)貴重藥物：紅細(xì)胞生成素（腫瘤化療的輔助藥物）；鐵蛋白（促進(jìn)鐵的吸收）；抗胰蛋白酶（治療囊性纖維化及肺氣腫）；凝血因子VIII及IX（治療血友病）；人血清白蛋白（治療燒傷）；2005年，年產(chǎn)值達(dá)350億美元。第四十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五利用細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)醫(yī)用蛋白的成本及產(chǎn)量比較

細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因牛培養(yǎng)液成本/元.L-1320~4002~4培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量/mg.L-110~501000~10000每克終產(chǎn)品的成本/元.g–16400~400000.15~4.00第四十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五人類科學(xué)史上的三大計(jì)劃之一人類基因組計(jì)劃（HGP）第四十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

1986年3月美國生物學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)得主Dulbecco首先提出——腫瘤研究的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：人類基因組的全序列分析

1990年，美國國會(huì)正式批準(zhǔn)，1990年10月1日開始實(shí)施，計(jì)劃耗資30億，歷時(shí)15年。HGP產(chǎn)生的背景第四十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五Celera遺傳公司的競(jìng)爭(zhēng)1998年5月一批科學(xué)家在美國羅克威爾組建Celera遺傳公司，計(jì)劃投入3億美元，到2001年繪制出完整的人體基因圖譜，與國際人類基因組計(jì)劃展開競(jìng)爭(zhēng)。第五十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

基因組與基因基因組：維持基本生理功能的一整套基因，即配子所含的基因總和，人23條染色體上的所有基因。第五十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五HGP的任務(wù)與進(jìn)展

15年內(nèi)，完成23對(duì)染色體上30億個(gè)核苷酸的測(cè)序并識(shí)別其中的基因。第五十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五2001年2月12日，由美國、日本、德國、法國、英國和中國組成的研究機(jī)構(gòu)及美國塞萊拉公司聯(lián)合宣布對(duì)人類基因組的初步分析結(jié)果：人類基因組有31.6億個(gè)核苷酸，3~3.5萬個(gè)基因；基因在染色體上不是均勻分布的，有些區(qū)域有很多的基因，有些區(qū)域（約1/4）則象“荒漠”；這意味著原來被認(rèn)為的“垃圾DNA”的功能應(yīng)該被重新認(rèn)識(shí)；不同種族有99.99%的相同基因，并不比同一種族不同個(gè)體之間的差異大。第五十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五人與黑猩猩DNA序列差異為1.44%2004年5月27日,英國《自然》雜志發(fā)表了我國科學(xué)家參與完成的人與黑猩猩比較基因組學(xué)研究取得的重大成果。科學(xué)家發(fā)現(xiàn),人與黑猩猩DNA序列差異為1.44%。第五十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五人與黑猩猩染色體比較第五十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五《Nature》公布精度大于99%人類基因組完成圖國際人類基因組計(jì)劃合作組織2004年10月21日在英國《自然》雜志上宣布，一張精度大于99%、誤差小于十萬分之一的人類基因組完成圖已成功繪就。經(jīng)過多國科學(xué)家近3年的精心“修纂”，原本（2001年）遺漏了15萬個(gè)細(xì)節(jié)的“人類生命天書”幾近完美地完成。完成圖顯示，龐大的人類基因組似乎只包含2萬至2.5萬個(gè)基因，大大少于此前估計(jì)。第五十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五幾種生物的基因數(shù)目比較第五十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五染色體測(cè)序的策略第五十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五沃森：“能看到自己的基因組圖譜，我感到非常興奮。”2007年5月在休斯敦的貝勒大學(xué)舉行的慶祝儀式上，79歲的沃森獲得了一張儲(chǔ)存著自己全部基因組序列的DVD光盤。沃森成為世界第一份完全破譯的“個(gè)人版”基因組圖譜的擁有者。由于采用了新的測(cè)序技術(shù)，不但只用了不到2年的時(shí)間，而且僅花費(fèi)了約100萬美元。第五十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五美國Celera公司創(chuàng)始人

溫特爾的基因圖譜成功繪出2007年9月克雷格?溫特爾的詳細(xì)基因組序列被公布，這是世界上第一個(gè)個(gè)體的二倍體基因組序列。發(fā)現(xiàn)溫特爾的兩組染色體序列存在0.5%的較大差異。他的APOE序列和SORL1基因均表明他存在較高的罹患早老性癡呆病和心血管病的風(fēng)險(xiǎn)；

第六十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五人類X染色體(1)研究人員在2005年3月1