基因工程菌的穩(wěn)定性

基因工程菌的穩(wěn)定性第一頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：

結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失

分配不穩(wěn)定性

整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）第二頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解

外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序

重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因

受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排第三頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解

外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序

重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因

受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排第四頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的穩(wěn)定性重組質(zhì)粒的逃逸率當含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。

重組質(zhì)粒逃逸的原因有：

高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料促使重組質(zhì)粒滲漏受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇第五頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五

影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素載體的選擇

遺傳特性宿主的選擇外源基因整合到宿主染色體上

培養(yǎng)基生長速率

發(fā)酵工藝限制性基質(zhì)溫度

pH和溶氧外源基因表達基因工程菌的穩(wěn)定性第六頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五

提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略

改進載體受體系統(tǒng)以增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：

將R1質(zhì)粒上的parB

基因引入表達型載體中其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞

正確設(shè)置載體上的多克隆位點禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)

將受體細胞的致死性基因安裝在載體上同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb

基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）基因工程菌的穩(wěn)定性第七頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五培養(yǎng)基

一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性

微生物在含有有機氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質(zhì)，微生物的生長較在基本培養(yǎng)基中快。

培養(yǎng)條件對基因工程菌穩(wěn)定性的影響第八頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五比生長速率

基因重組菌的比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響。提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性?；蛑亟M菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和pH下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素。培養(yǎng)條件對基因工程菌穩(wěn)定性的影響第九頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五限制性基質(zhì)一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會受到一種或幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對重組菌有不同的影響培養(yǎng)條件對基因工程菌穩(wěn)定性的影響第十頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五pH和溶解氧

pH和溶氧影響重組酵母菌的穩(wěn)定性。

pH和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時，通常都需要維持一定的pH和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。培養(yǎng)條件對基因工程菌穩(wěn)定性的影響第十一頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五外源基因的表達

外源基因的表達會引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定外源基因高效表達時，有可能因競爭利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細胞的正常代謝活動，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。例如，吲哚丙烯酸（IAA）是trp操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌MV12（pVH5）時，在培養(yǎng)基中加入不同量的IAA，發(fā)現(xiàn)隨IAA量的增加，pVH5帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達水平有很大提高，同時比生長速率下降，培養(yǎng)液中Trp－

的比例上升。電泳分析表明60%～70%色氨酸合成能力喪失是由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，其余是由于質(zhì)粒丟失造成。培養(yǎng)條件對基因工程菌穩(wěn)定性的影響第十二頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略施加選擇壓力

根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素

藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素

加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力

載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法第十三頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略

分階段控制培養(yǎng)

因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達。連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進行生長，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級進行表達。

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法第十四頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略

控制目的基因的過量表達使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)

優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法第十五頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略

優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝

工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH和溶解氧濃度。有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法第十六頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略控制培養(yǎng)條件有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。例如研究表達干擾素a

的大腸桿菌W3110(pEC901)在不同比生長速率下的質(zhì)粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價也明顯增大.

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法第十七頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五

提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略固定化

固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達率都有了很大提高。在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。第十八頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的發(fā)酵工藝第七節(jié)基因工程菌的培養(yǎng)第十九頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有：

分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限

半連續(xù)培養(yǎng)（補料分批）在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細胞進一步的生長，或得到更多的代謝產(chǎn)物

連續(xù)培養(yǎng)不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。

連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究。

透析培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)方式第二十頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五補料分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式第二十一頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對基因表達的影響等創(chuàng)造了良好的條件。但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細胞比生長速率。優(yōu)化這三個參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進入第二階段后可獲得最高表達水平或最大產(chǎn)率?；蚬こ叹囵B(yǎng)方式第二十二頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補充養(yǎng)分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體。膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時間段都對產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響。基因工程菌培養(yǎng)方式第二十三頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利。由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展?；蚬こ叹呐囵B(yǎng)方式第二十四頁，共三十頁，編輯于2023年，星期五基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備

應(yīng)用發(fā)酵罐來大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。為了防止工程菌丟失攜帶的質(zhì)粒，保持基因工程菌的遺傳特性，因而對發(fā)酵罐的要求十分嚴格。由于生化工程學(xué)和計算機的發(fā)展，新型自動化發(fā)酵罐完全能滿足這些要求。常規(guī)的微生物發(fā)酵設(shè)備可直接用于基因工程菌的培養(yǎng)。不同點在于，微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產(chǎn)物，細胞生長并非主要目標?；蚬こ叹囵B(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)是相對獨立于細胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細胞并不需要的蛋白