由蘇木素氧化原理談蘇木素染液配制過程中的幾個問題

由蘇木素氧化原理談蘇木素染液配制過程中的幾個

問題一、蘇木素的氧化反應(yīng)產(chǎn)物蘇木素!氧化蘇木素（為需要的產(chǎn)物，染色的成分。氧化分子中一個羥基成為羰基，形成共軛n鍵）!過氧化蘇木素（其余的羥基進(jìn)一步被氧化，共軛n鍵破壞，發(fā)色團(tuán)破壞，失去顏色）二、蘇木素染液配制選用的氧化劑種類、氧化劑使用劑量。1、常用氧化劑的比較半反應(yīng)氧化還原半反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)電極電位氧氣（02）02+4H++2e——>2H201.229氧化汞（HgO）Hg2++2e—一Hg0.851碘酸鈉（NaI03）2I03—+12H++10e——>I2+6H201.195高錳酸鉀（KMnO4）Mn04+8H++5e一Mn2++4H201.507氧化還原半反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)電極電位值越大，得電子的能力越強(qiáng)，氧化力越強(qiáng)。氧化能力弱的氧化劑反應(yīng)速度慢，升高反應(yīng)體系的溫度以加快反應(yīng)速度，越強(qiáng)的氧化劑的反應(yīng)速度越快，須控制反應(yīng)體系的溫度使反應(yīng)速度減慢。2、不同氧化劑的使用劑量根據(jù)蘇木素氧化反應(yīng)式可以計算出氧化1克純蘇木素所需要的不同氧化劑量(理論值)。C16H14O6+HgOfC16H12O6+Hg!+H2O摩爾質(zhì)量302.28 216.61TOC\o"1-5"\h\z質(zhì)量 1g 0.72g6C16H14O6+2NaIO3f6C16H12O6+I2+6H2O+2Na+摩爾質(zhì)量302.28X6 197.9X2質(zhì)量 1g 0.2g4C16H14O6+KMnO4f4C16H12O6+4H2O+Mn2++K+摩爾質(zhì)量302.28X4 158.03質(zhì)量 1g 0.13g注意：這是理論值，在實(shí)際配制染液時，氧化劑的使用量要減少至理論值的1/2量為宜。理由：、我們使用的氧化劑品質(zhì)多為分析純的，含量比較保證，而蘇木素為天然染料，含量不是很保證，所以氧化劑需減少用量。、配制染液時應(yīng)刻意保留1/3量的蘇木素不被氧化，使之在使用過程中再被氧化，令染液耐用。三、媒染劑的使用氧化蘇木素羰基中的氧原子最外層軌道含有孤對電子，能與A13+++、Fe3+++等金屬離子形成外軌型配合物。氧化蘇木素通過金屬離子與細(xì)胞核內(nèi)DNA雙鏈外側(cè)磷酸基上帶有孤對電子的氧原子形成配位鍵而使細(xì)胞核內(nèi)的DNA著色。媒染劑的使用不但大大提高了氧化蘇木素對DNA的上染率，也加強(qiáng)了染液的水洗牢度。媒染劑一般為二價或三價金屬的鹽或氫氧化物。常用于蘇木素染液配制的媒染劑為KAl(SO4)2?12H2O、FeK(SO4)2?12H2O、NH4Fe(SO4)2?12H2O等，也可以用其他的如A12(SO4)3?18H2O、A1C13?6H2O、FeC13?6H2O等可電離A13+++或Fe3+++的鹽作為媒染劑。四、乙酸的使用冰乙酸的作用是降低蘇木素染液的PH值，增強(qiáng)DNA著色的特異性，減少蛋白質(zhì)的非特異性著色。蛋白質(zhì)分子具有游離的氨基端與羧基端，為兩性分子。溶液的PH值高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)羧基端電離時負(fù)電，與氧化蘇木素的A13+++結(jié)合，引起蛋白質(zhì)的非特異性染色。當(dāng)溶液的PH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)的羧基端不電離，而氨基端以陽離子形式存在，與A13+++相斥，氧化蘇木素不能與蛋白質(zhì)結(jié)合，減少蛋白質(zhì)的非特異性染色。五、蘇木精染液常見問題的原因分析及解決方法1、蘇木精染液表面“氧化膜”與沉淀的形成蘇木精染液表面的氧化蘇木精與空氣中的氧氣接觸而進(jìn)一步氧化，氧化蘇木精3位羥基被氧化成羰基，羰基氧原子的孤對電子充分暴露在外，更容易進(jìn)入A13+++的雜化空軌道形成配位鍵，使過氧化物形成聚合物。蘇木素染液表層過氧化物氧聚合物成片層樣，形成“氧化膜”，溶液內(nèi)部的過氧化物聚合物形成沉淀。解決辦法：、避免氧化反應(yīng)過度引起過氧化蘇木精增多。染液加入丙三醇：丙三醇俗稱甘油，丙三醇1、2、3位均連有一個羥基(極性基團(tuán))，羥基中的H原子帶部分正電荷，與氧化蘇木精分子中的羥基上的O原子(帶部分正電荷)形成氫鍵。丙三醇分子占據(jù)了氧化蘇木精的羥基旁的位置形成“空間阻隔效應(yīng)”，有效阻斷了A13+++與O原子形成配位鍵，使氧化蘇木精分子不能聚合，減少了沉淀和“氧化膜”的產(chǎn)生。2、蘇木精染液染色能力下降過快。蘇木精染液染色能力下降的原因：（1） 蘇木精染液在使用過程中，因染液中的氧化蘇木精濃度逐步降低導(dǎo)致的染色顏色變淡，此屬正?，F(xiàn)象。（2） 染液中的氧化蘇木精進(jìn)一步被氧化成過氧化物，過失去染色能力。根據(jù)化學(xué)反應(yīng)平衡原理及化學(xué)反應(yīng)速率理論，蘇木精染液配制時，反應(yīng)物濃度逐漸下降，生成物濃度逐漸增加，氧化反應(yīng)達(dá)到了初步的平衡。但在反應(yīng)體系中依舊存在低濃度未反應(yīng)的氧化劑離子（Hg+、IO3-等），在染液使用過程中，染液中的氧化劑繼續(xù)緩慢的進(jìn)行氧化作用，使染液中的氧化蘇木精蘇木精進(jìn)一步被氧化。染色過程中將自來水帶入蘇木精染液也是形成過氧化物的重要原因：目前，我國自來水消毒劑常用C12（1L水中通過0.002gC12）。C12與水反應(yīng)生成HC1O，C1O—具有很強(qiáng)的氧化能力，將氧化蘇木精繼續(xù)氧化成過氧化蘇木精，加速染液“變舊”。使蘇木素染液耐用的方法：（1） 配制過程中氧化劑的使用量要合適：氧化劑的使用量要減少至理論值的1/2量為宜。目前生產(chǎn)蘇木素的廠家很多，蘇木素的純度高低不一。需根據(jù)蘇木素的質(zhì)量適當(dāng)調(diào)整氧化劑的使用量。配制結(jié)束時染液中依舊存在一定濃度的蘇木素未被氧化，以“應(yīng)付”染液在放置和使用過程中氧化劑的繼續(xù)氧化反應(yīng)，盡量減少染液中的過氧化蘇木素的生成。（2） 配制過程中對溫度和反應(yīng)時間的控制要合適。HgO的最佳反應(yīng)溫度為90~100°C反應(yīng)5分鐘后快速冷卻，NaIO3，KMnO4在室溫下（25°C）進(jìn)行氧化反應(yīng)，如果溫度過高，氧化反應(yīng)將會過快，蘇木素被直接氧化成為過氧化物，導(dǎo)致具有染色能力的氧化蘇木素濃度低下，導(dǎo)致染色效果差。染色過程中減少自來水帶入染液。進(jìn)入蘇木素染液前用蒸餾水洗切片或?qū)⒆詠硭M量甩干再放入染液染色，可有效延長蘇木素染液的使用壽命。何細(xì)胞涂片用酒精固定不容易脫片？有一個經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象不知大家曾經(jīng)仔細(xì)觀察并思考過原因沒有：用95%酒精固定的組織切片與甲醛固定的組織切片有什么不同？酒精固定的組織切片出現(xiàn)胞漿胞核“一邊倒”的現(xiàn)象是什么原因？如果把這個問題想清楚了，也會明白為啥細(xì)胞涂片用酒精固定不會脫片了“酒精固定的差異在核染色質(zhì)