第八章免疫標(biāo)記技術(shù)2

優(yōu)選第八章免疫標(biāo)記技術(shù)Ppt1當(dāng)前第1頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)2免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng);三大標(biāo)記技術(shù):

同位素標(biāo)記技術(shù)免疫熒光技術(shù)

酶免疫測定當(dāng)前第2頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)3標(biāo)記免疫技術(shù)1.免疫熒光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）3.放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）4.化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）

5免疫印跡法（immunoblotting,Westernblot)當(dāng)前第3頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)4第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoassay,RIA）當(dāng)前第4頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)5

放射性同位素(131I,或125I)標(biāo)記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結(jié)果。該法常用于測定微量物質(zhì):如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)gE等。當(dāng)前第5頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)6VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA

當(dāng)前第6頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)7

與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析技術(shù)測定甲狀腺素獲得成功；開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的新時代，是微量分析方法學(xué)上的一個突破。當(dāng)前第7頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)8優(yōu)點(diǎn)：①特異性強(qiáng)，即抗原抗體的特異性反應(yīng)；②靈敏度高，結(jié)果精確，檢測范圍10-910-12g；③操作流程簡單易行，測量和數(shù)據(jù)處理自動化；④樣品用量少、無需復(fù)雜的提純步驟；⑤應(yīng)用范圍廣泛，尤其是測量小分子半抗原。缺點(diǎn)：需要昂貴的檢測儀器；同位素污染。當(dāng)前第8頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)9原理

是建立在標(biāo)記抗原（或配體）和待測抗原（或配體）對有限量的特異性抗體（或受體）的競爭性抑制反應(yīng)基礎(chǔ)上的，最終形成的放射性標(biāo)記復(fù)合物與被測配體（或抗原）呈負(fù)相關(guān)，因而亦稱競爭性放射免疫技術(shù)。當(dāng)前第9頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)10

Ag*+ Ab?Ag*-Ab

（F）（B）

+Ag ?Ag-Ab

當(dāng)前第10頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)11RIA測定原理的定量示意圖

Ag*AgAbAgAb游離AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/8當(dāng)前第11頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)12返回當(dāng)前第12頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)13

第二節(jié)免疫熒光法

(immuno–fluorescencetechnique

)當(dāng)前第13頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)14原理

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。將抗體或抗原標(biāo)記以熒光素，然后與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀（熒光顯微鏡或用流式細(xì)胞儀）測定或定位被檢抗原或抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)呈黃綠色熒光;

巰基化藻紅蛋白(PE)呈橙紅色熒光。當(dāng)前第14頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)15當(dāng)前第15頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)16激發(fā)光和發(fā)射光當(dāng)前第16頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)17

抗原抗體反應(yīng)的高度特異性熒光的敏感可測性顯微技術(shù)的高度精確性

準(zhǔn)確、特異、靈敏、快速地檢測和定位微量物質(zhì)。當(dāng)前第17頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)18優(yōu)點(diǎn)：

特異性強(qiáng)，速度快，敏感性高，能準(zhǔn)確檢測少量抗原或抗體在組織細(xì)胞內(nèi)的定位分布。缺點(diǎn)：

非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足。

返回當(dāng)前第18頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)19建立技術(shù)的必備條件1．

熒光素2．熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備3．熒光檢測儀返回當(dāng)前第19頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)20熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。當(dāng)前第20頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)21

熒光的種類

自發(fā)熒光

二次熒光當(dāng)前第21頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)22常用的熒光素返回當(dāng)前第22頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)23熒光檢測儀

（1）熒光顯微鏡（2）熒光分光光度計(jì)（3）流式細(xì)胞儀（4）熒光偏振光分析儀

當(dāng)前第23頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)24熒光顯微鏡當(dāng)前第24頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)25熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈當(dāng)前第25頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)26分類：（1）直接熒光法:

（2）間接熒光法:

（3）流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry):

樣品(細(xì)胞)經(jīng)各種熒光素標(biāo)記的不同抗體染色后可同時分析細(xì)胞表達(dá)的多種分子。當(dāng)前第26頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)27(1)免疫熒光法：

①直接法:

簡單、快速、特異;敏感性差。

將熒光素標(biāo)記在特異性抗體上，直接檢測抗原。當(dāng)前第27頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)28返回當(dāng)前第28頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)29②間接法:

可檢測多種不同的抗原抗體復(fù)合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程長、干擾因素多。將熒光素標(biāo)記在第二抗體（抗抗體）上或標(biāo)記在SPA上，檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體。當(dāng)前第29頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)30當(dāng)前第30頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)31③補(bǔ)體熒光染色法：

將熒光素標(biāo)記在補(bǔ)體的抗體上（抗C3抗體），檢測抗原抗體復(fù)合物?？蓹z測所有的抗原抗體系統(tǒng)，具通用性；敏感性高；但操作流程長、干擾因素多、非特異性熒光多，補(bǔ)體易失活、需新鮮制備不方便。當(dāng)前第31頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)32當(dāng)前第32頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)33當(dāng)前第33頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)34特殊染色法

①

雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)②雙色免疫熒光技術(shù)③反襯染色法

返回當(dāng)前第34頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)35①雙標(biāo)記免疫熒光技術(shù)

在同一標(biāo)本中，可用兩種不同顏色的熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫熒光染色，同時顯示兩種不同的細(xì)胞或同一細(xì)胞上不同類型的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）和RB200或TRITC9（桔紅色熒光）。當(dāng)前第35頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)36②雙色免疫熒光技術(shù)

如FITC標(biāo)記抗體和細(xì)胞核染色劑PI（碘化丙錠）。

當(dāng)前第36頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)37雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI當(dāng)前第37頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)38多重染色標(biāo)本的多色觀察（FITC+TexasRed+DAPI）返回當(dāng)前第38頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)39當(dāng)前第39頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)40③反襯染色法

是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標(biāo)記牛血清白蛋白作為非特異性反襯標(biāo)記，用FITC標(biāo)記特異性抗體。當(dāng)前第40頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)41當(dāng)前第41頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)42流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)

是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。

當(dāng)前第42頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)43當(dāng)前第43頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)44FACS組成示意圖當(dāng)前第44頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)當(dāng)前第45頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)46流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第46頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)47當(dāng)前第47頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)48表達(dá)量檢測

當(dāng)前第48頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)49細(xì)胞凋亡研究

PI染色當(dāng)前第49頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)50AV-PI雙染色當(dāng)前第50頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)51血液學(xué)應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細(xì)胞周期分析，淋巴細(xì)胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細(xì)胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細(xì)胞吞噬功能測定，NK和LAK細(xì)胞活性測定，造血干/祖細(xì)胞測定等當(dāng)前第51頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)52胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測當(dāng)前第52頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)53T細(xì)胞亞群分析當(dāng)前第53頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)54第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

（enzymeimmunoassaytechnique）

1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs兩組學(xué)者分別用酶代替放射性同位素制備了酶標(biāo)記試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)（enzymeimmunoassay，EIA）。當(dāng)前第54頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)55第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技術(shù)是通過適當(dāng)?shù)拿复倩瘜W(xué)反應(yīng)和免疫反應(yīng)，使抗體（或抗原）與酶蛋白分子結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體（或抗原）,該結(jié)合物保留免疫學(xué)活性的酶活性,因而既有抗原抗體反應(yīng)特異性,又有酶促反應(yīng)的特異性。酶分解底物后的顯色深淺可反映標(biāo)本中抗原或抗體的含量。常用酶：辣根過氧物酶、堿性磷酸酶。常用方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)――ELISA當(dāng)前第55頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)56一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D2：D1的氧化型有色化合物

將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。當(dāng)前第56頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)57優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高，特異性強(qiáng)；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體；③試劑穩(wěn)定，保存時長，無同位素污染；④可肉眼半定量，也可儀器（低廉）定量檢測；⑤操作簡便，易于掌握和使用，且重復(fù)性好；⑥可用于定位組織細(xì)胞上的抗原或抗體成分。缺點(diǎn)：

標(biāo)記反應(yīng)較難掌握，在操作過程中容易引起酶、抗原或抗體的失活。當(dāng)前第57頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)58

建立技術(shù)的條件

1．標(biāo)記酶2．免疫酶結(jié)合物的制備3．酶標(biāo)檢測儀當(dāng)前第58頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)59常用的標(biāo)記酶

①辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）②堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）③葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）④-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）當(dāng)前第59頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)60當(dāng)前第60頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)61當(dāng)前第61頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)62二、基本類型均相酶免疫測定法酶增強(qiáng)免疫技術(shù)；酶減弱免疫技術(shù)；輔基標(biāo)記技術(shù)2.非均相酶免疫測定法

ELISA(直接法、間接法、夾心法、競爭法、抗酶抗體法）1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）當(dāng)前第62頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)63直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）當(dāng)前第63頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)64directELISA（forAg）當(dāng)前第64頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)65directELISA（forAb）返回當(dāng)前第65頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)66當(dāng)前第66頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)67當(dāng)前第67頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)68返回當(dāng)前第68頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)69

（3）夾心法

（sandwichassay）當(dāng)前第69頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)70夾心法當(dāng)前第70頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)71雙夾心法返回當(dāng)前第71頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)72當(dāng)前第72頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)73當(dāng)前第73頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)74ELISA雙抗體夾心法(測Ag)間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復(fù)合物，洗滌加該Ag的另一Ab（酶標(biāo)），洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復(fù)合物，洗滌加酶標(biāo)二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反應(yīng)板當(dāng)前第74頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)75當(dāng)前第75頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)76抗酶抗體法（PAP）當(dāng)前第76頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)77血清IgE的檢測實(shí)驗(yàn)材料酶標(biāo)板（聚苯乙烯微量板）馬抗人抗體—（購自北京中山公司）辣根過氧化物酶（）標(biāo)記的馬抗人抗體—待檢血清包被緩沖液：碳酸鈉碳酸氫鈉洗滌液封閉液：溶液反應(yīng)終止液：當(dāng)前第77頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)78實(shí)驗(yàn)方法包被酶標(biāo)反應(yīng)板：加馬抗人抗體（），孔℃孵育小時后洗滌次，分鐘次，孔，℃過夜孔

↓℃孵育后，洗滌同上酶標(biāo)記抗體：加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗體，孔℃孵育后，洗滌同上底物：加入（鄰苯二胺）溶液，孔

↓室溫分鐘終止液：加入，孔

↓內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定各孔值，測定波長實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用待測標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均吸收值的比值（）

表示，當(dāng)大于某一數(shù)值時（如）判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。當(dāng)前第78頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)79（4）競爭法 a．固相抗體競爭法

b．固相抗原競爭法 當(dāng)前第79頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)80

a．固相抗體競爭法當(dāng)前第80頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)81

b．固相抗原競爭法返回當(dāng)前第81頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)82夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于檢測小分子Ag）當(dāng)前第82頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)83返回（5）抗體橋聯(lián)法

（immunobridge）當(dāng)前第83頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)84（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiperoxidase，PAP）當(dāng)前第84頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)85PO

抗

PO法返回當(dāng)前第85頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)86酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

當(dāng)前第86頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)87當(dāng)前第87頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)88ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個斑點(diǎn)代表1個細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量，還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。當(dāng)前第88頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)89原理

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。當(dāng)前第89頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)90DirectandIndirectElISPOT

可在已包被抗體的孔中直接刺激細(xì)胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細(xì)胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。方法選擇基于：1）檢測細(xì)胞的類型；2）希望得到的細(xì)胞量。若只需少量的細(xì)胞因子生成細(xì)胞，使用直接法；反之，最好使用間接法。其它步驟一致。當(dāng)前第90頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)91ElISPOT操作過程當(dāng)前第91頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)92當(dāng)前第92頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)93當(dāng)前第93頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)94當(dāng)前第94頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)95操作過程

1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。2.倒去酒精，用100ulPBS洗滌3次。3.將100ul捕獲抗體加入10mlPBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。4.倒去液體，100ulPBS洗滌一次。5.每孔加入100ul2%脫脂乳PBS（見試劑準(zhǔn)備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。7.用100ulPBS洗滌一次。8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液（含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。當(dāng)前第95頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)9611.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次12.于10mlPBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。14.每板以10mlPBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。16.每孔加入100ulBCIP/NBT。17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一夜，點(diǎn)會比較明顯。當(dāng)前第96頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)97當(dāng)前第97頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)98當(dāng)前第98頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)99當(dāng)前第99頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)100返回當(dāng)前第100頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)101當(dāng)前第101頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)102四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)2．ABC放大系統(tǒng)返回當(dāng)前第102頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)103（1）SPA的發(fā)現(xiàn)

1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)中出現(xiàn)沉淀線。1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細(xì)菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA)當(dāng)前第103頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)104Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為非特異免疫反應(yīng)。生產(chǎn)SPA的國際標(biāo)準(zhǔn)菌株:CowanⅠ株（NcTc8530和ATCC12598）不生產(chǎn)SPA的標(biāo)準(zhǔn)株:Wood46

返回當(dāng)前第104頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)105（2）顆粒SPA的應(yīng)用

協(xié)同凝集試驗(yàn)SPA吸收IgG試驗(yàn)應(yīng)用IgG-SPA制備抗IgG的抗體返回當(dāng)前第105頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)106（3）SPA的標(biāo)記和應(yīng)用

熒光素標(biāo)記SPA及應(yīng)用酶標(biāo)記SPA及應(yīng)用

當(dāng)前第106頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)107酶標(biāo)SPA法返回當(dāng)前第107頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)108ABC放大系統(tǒng)

生物素-親合素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem）

高度特異性高度靈敏性簡單快速安全穩(wěn)定

當(dāng)前第108頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)109（1）生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性

生物素（biotin，B）又稱維生素H、輔酶R（羧基轉(zhuǎn)化酶的輔酶）

MW244.31，pI3.5

分子式為C10H16O3N2S當(dāng)前第109頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)110當(dāng)前第110頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)111Biotin當(dāng)前第111頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)112親合素（avidin，A）

又稱卵白蛋白、抗生物素。

MW68,000，pI10～10.5，為堿性蛋白，含糖量高達(dá)10%；

1個親合素可與4個生物素結(jié)合；

Ka=1015mol/L當(dāng)前第112頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)113鏈霉親合素（streptavidin，SA）：

是Streptomycesavidin菌分泌的一種蛋白質(zhì)。

MW65000，pI6.0，為略偏酸性的蛋白，不含任何糖基

1個鏈霉親合素可與4個生物素結(jié)合

Ka=1015mol/LSA比A在實(shí)際應(yīng)用中靈敏度要高、非特異性反應(yīng)要少。返回當(dāng)前第113頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)114（2）生物素的標(biāo)記技術(shù)

生物素的活化活化生物素結(jié)合物的制備活化生物素可結(jié)合或偶聯(lián)抗體、酶、蛋白質(zhì)、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等

當(dāng)前第114頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)115（4）生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用當(dāng)前第115頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)116返回當(dāng)前第116頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)117四、ELISA方法的發(fā)展1.酶聯(lián)免疫熒光測定法當(dāng)前第117頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)1182.IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（IgMantibodycaptureELISA,MAC-ELISA)當(dāng)前第118頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)1193.斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA)當(dāng)前第119頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)120當(dāng)前第120頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)121三、免疫金溶膠技術(shù)當(dāng)前第121頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)122

膠體金試紙條診斷是采用斑點(diǎn)免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是90年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等檢測。（4）斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)

（dotimmunochromatographicassay,DICA)當(dāng)前第122頁\共有135頁\編于星期三\10點(diǎn)123

膠體金（Collo