蛋白折疊及折疊中間體的研究

提綱開展本項研究的意義當前相關研究綜述幾種常用的預測方法我們的研究興趣與思路虛擬實驗室1當前第1頁\共有57頁\編于星期三\15點1研究概述蛋白質是生命的重要分子，幾乎在所有的生物學過程中都扮演著重要的角色。因此，關于其結構與功能方面的研究一直是人們關注的焦點。蛋白質生物功能的關鍵在于其空間構象，一個伸展開來或隨機排布的肽鏈是沒有生物活性的。雖然X射線晶體學和NMR技術是蛋白質結構測定的有效手段，但卻遠遠跟不上飛速發(fā)展的DNA測序，它使得蛋白質氨基酸序列的信息以爆炸的方式增長，由此迫切需要直接由蛋白質的氨基酸序列出發(fā)進行高級結構的預測。目前，對一定氨基酸序列的多肽鏈折疊形成特定空間結構蛋白質的機制了解甚少。雖然已經(jīng)發(fā)展了多種經(jīng)驗和理論的計算方法預測蛋白質結構，并取得了某些成功，但總體來說仍是一個尚未解決的難題。

2當前第2頁\共有57頁\編于星期三\15點

...Scientifically,thefoldingofaproteininall-atomdetailisaholygrailofmoderncomputationalbiology

...

-VijayPande,StanfordUniversity3當前第3頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質的4級結構一級結構（Primary）-氨基酸序列二級結構（Secondary）-螺旋（alphahelix）-片層（betasheet）-盤繞（旋轉）三級結構（Tertiary）-3D構象四級結構（Quaternary）-多肽鏈組合4當前第4頁\共有57頁\編于星期三\15點了解3D結構的重要意義幫助我們了解蛋白質序列和結構之間的關系幫助我們了解蛋白質結構和功能之間的關系幫助我們發(fā)現(xiàn)新藥物和改進藥物的設計5當前第5頁\共有57頁\編于星期三\15點影響3D結構的幾個要素氨基酸的物理化學性質氨基酸的相對位置二面角的限制性氨基酸的親水、疏水性局部二級結構傾向內部穩(wěn)定化因子氫鍵,二硫鍵,鹽橋6當前第6頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質結構的實驗測定X-ray晶體衍射需要生長蛋白質晶體（這對一部分蛋白質幾乎是不可能的，總之，不容易）衍射圖樣能進行反傅立葉變換來表征電子密度（這有“相”的問題）核磁共振譜（NMR）

能提供距離約束，但很難發(fā)現(xiàn)對應的結構只適用于相對較小的蛋白質7當前第7頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質結構的理論預測晶體衍射（X-ray）和核磁共振（NMR）實驗所獲得的結構數(shù)據(jù)遠遠滿足不了需要在人體蛋白中，只有3571

個可在PDB數(shù)據(jù)庫中找到30-50%的讀碼框（OpenReadingFrames）無法找到已知同源相似物理論預測可以用于結構相似性研究，進而有助于蛋白質功能分析8當前第8頁\共有57頁\編于星期三\15點溶液中的蛋白質是一個受到各種力作用的原子系統(tǒng)：化學鍵力、氫鍵力、庫侖力、范德華力等。在適當?shù)臈l件下，這些作用力將促使幾乎任意初始構形的蛋白質折疊成為穩(wěn)定的、良好定義的3D結構（nativestate）（在毫秒到秒的時間量級）。這是蛋白質3D結構abinitio（denovo）預測的基礎。9當前第9頁\共有57頁\編于星期三\15點另一方面，經(jīng)過百萬年的演變，蛋白質形成了一族類，具有相似的序列、相似的結構、以及相關的功能。這是蛋白質結構預測的另一類方法－同源性比較方法的基礎。10當前第10頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質結構的理論預測11當前第11頁\共有57頁\編于星期三\15點結構預測的基本要求

要求優(yōu)先度難度精確性55快速3－42－3自我校正42－3一致性42程序易用性2－3212當前第12頁\共有57頁\編于星期三\15點2相關研究綜述（分子動力學，MD）蛋白質結構預測蛋白質的折疊－解折疊蛋白質－配體識別酶核酸（DNA,RNA）水化（溶劑化）生物膜雙分子脂質層離子通道13當前第13頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質的結構預測溶液中，蛋白質是一個受到各種力作用的原子系統(tǒng)：化學鍵力、氫鍵力、庫侖力、范德華力等。在這個綜合力場中，運用分子動力學（MD）模擬，得到蛋白質分子的各種可能構象（軌跡）。通過對各種可能構象進行全局自由能最小搜索，預測蛋白質的3D結構。特點：建立在物理原理（定律）的基礎上。僅從蛋白質的氨基酸序列出發(fā)。不依賴模型化序列與任何已知結構在折疊水平上的相似性。14當前第14頁\共有57頁\編于星期三\15點1－40A多肽，水溶液，沿著優(yōu)化的過渡路徑的結構變化，從折疊的線圈（coil）結構到-螺旋結構15當前第15頁\共有57頁\編于星期三\15點1－40A多肽，水溶液，沿著優(yōu)化的過渡路徑的結構變化，從折疊的線圈狀態(tài)到折疊的-片層目標構型16當前第16頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質的折疊－解折疊關于蛋白質熱變性的解折疊過程的MD模擬研究表明：解折疊的總體路徑與溫度無關。溫度升高，只不過過程加速。折疊的過程與解折疊過程有直接的關系。這兩點與以往的認識截然不同。理由：模擬觀測到的再折疊（refolding）過程正好與在高溫解折疊模擬中所觀察到的相反。17當前第17頁\共有57頁\編于星期三\15點一些蛋白質的本性結構（N）和過渡態(tài)結構（TS）的MD模擬結果18當前第18頁\共有57頁\編于星期三\15點溶菌酶解折疊過程的MD模擬，經(jīng)過了一系列的中間態(tài)（I），這些不同于螺旋的填充（packing）。D表示變性體。19當前第19頁\共有57頁\編于星期三\15點通過MD模擬Barnase的解折疊過程反過來研究其可能的折疊路徑。D表示變性體。20當前第20頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質－配體識別蛋白質－配體識別與生物分子的自由能模擬得益于一些重要方法的改進（和計算機能力的提高）。分子識別的研究能夠幫助人們理解超出相互作用本身所涉及的更多信息，是對實驗研究的重要補充。Poisson-Boltzmann靜電模型提供了一個較快又較簡單的自由能模擬方法，這種情況下靜電相互作用是主要的。研究了天冬氨酸

tRNA合成酶對氨基酸的識別，這些特征對于保持遺傳密碼的完整性是非常重要的。21當前第21頁\共有57頁\編于星期三\15點Asp和Asn對天冬氨酸t(yī)RNA合成酶（AspRS）成鍵的熱力學循環(huán)成鍵自由能變化的計算有兩種方法ΔΔG=ΔG1－ΔG2（Alchemical）ΔΔG=ΔG4－ΔG3（Chemical）22當前第22頁\共有57頁\編于星期三\15點蛋白質－配體間相互作用以力場能為基礎來確定配體與蛋白質之間的相互作用和熱力學構象所進行的簡單自由能計算在配體結構設計方面是非常有用的工具。線性相互作用能方法計算配體鍵自由能的MD模擬。優(yōu)勢：在配合物中僅僅考慮配體之間的相互作用就可確定鍵合能。應用在leadoptimization方面有前景蛋白質之間的相互作用離子通道23當前第23頁\共有57頁\編于星期三\15點酶MD模擬正在引導我們對酶的生物活性有一個更深入的了解。模擬可以告訴我們反應物（配體）是如何從酶的表面運動到內藏的活性部位的，以及這種運動的逼真圖像。提出了酶活性調節(jié)的可能模式?；就ǖ榔款i的張合運動影響反應物與活性中心的鍵合。動力學選擇性：酶在正常狀態(tài)下瓶頸的張合可能不會明顯影響與反應物的鍵合，但較大的反應物分子可能會在有一個足夠大的張開前即由于擴散而逃走。動力學選擇性可能代表生物分子識別中的一種更普遍的現(xiàn)象。24當前第24頁\共有57頁\編于星期三\15點乙酰膽堿酯酶（AChE），配體到達活性部位的幾率由基本通道（喉）頸寬度的波動所控制。也可能在很短暫的時間內活性部位和蛋白質表面會出現(xiàn)一個第二通道（后門）。25當前第25頁\共有57頁\編于星期三\15點AChE通道（喉）“開”與“關”的構象比較（模擬結果）。Ser203位于活性中心。26當前第26頁\共有57頁\編于星期三\15點核酸（DNA,RNA）核酸的MD模擬，數(shù)皮秒的時間標度?？梢垣@取核酸序列以及各種溶劑條件對結構和分子的運動的影響信息。大到象tRNA這樣的分子。在非常詳細的層面上跟蹤構型變化的過程。核酸形成的大的生物分子配合物研究。時間尺度提升至數(shù)百皮秒。全溶劑化的核酸系統(tǒng)的分子模擬已逐步面向實際體系。算法的改進已使得高度變化的核酸體系的精確MD模擬成為可能。更復雜的反應，如RNA催化及折疊等，仍依賴于更強大的計算機。27當前第27頁\共有57頁\編于星期三\15點ApA二聚體的自由能、基礎角、可到達表面積對反應坐標作圖ApA的堆疊構型28當前第28頁\共有57頁\編于星期三\15點水化（溶劑化）描述生物大分子周圍的溶劑（水）分子分布。V.Makarov等人從實驗、理論和模擬等方面綜述了這一領域近5年的研究進展。結論大多數(shù)情況下，生物大分子在溶劑中不僅僅是一般的溶解，在與周圍水分子的作用方式上，局域水化模式下水分子的分布更加切合實際，而不同于游離的水分子。在溶液中，局域化的水分子往往是與大分子締合在一起的。描述了接近DNA和蛋白質分子表面的界面溶劑分子的結構（分布）。29當前第29頁\共有57頁\編于星期三\15點抹香鯨肌紅蛋白的水化水化位置（藍，實驗），水化數(shù)密度最大值（黃，MD模擬）30當前第30頁\共有57頁\編于星期三\15點肌紅蛋白周圍溶劑數(shù)的3D密度分布，由MD軌跡切片計算得到。溶劑密度由肌紅蛋白的平均結構覆蓋。等密度線：0.005（藍），0.01（綠），0.02（黃），0.035（紅）（a）由模擬結果得到（b）由模型預測31當前第31頁\共有57頁\編于星期三\15點由MD模擬得到的DNA周圍的溶劑化密度。最大值（實線）和最小值（虛線）黃點為X射線分析結果。二者符合良好。32當前第32頁\共有57頁\編于星期三\15點生物膜與雙分子脂質層最近10年，計算機模擬已經(jīng)深入到能夠認識生物膜性質的水平，包括DNA與脂質體的相互作用、形成微孔的跨膜肽對脂質體環(huán)境的影響、以及揮發(fā)性麻醉分子的分配等。這些模擬中，所有的原子都是受限在小于10nm的空間內，這個模型搭起了全原子細節(jié)與介觀區(qū)域之間的橋梁。以磷脂體中的麻醉劑分子為例進行了研究。DNA與脂質體混合物作為重要的生物物質，是因為它們是基因的攜帶者。33當前第33頁\共有57頁\編于星期三\15點MD模擬5.5ns后DMPC（中性脂質體）/DMTAP（陽離子脂質體）與DNA的聯(lián)合體構型。（a）垂直于DNA軸（b）平行于DNA軸。DNA和脂質體的“頭”P、N用球表示，“尾（疏水鏈）”用棍表示。各原子的顏色：N,藍色；O,紅色；P,黃色;C（DNA）,灰色；C（脂質體）,綠色；H,暗灰色。34當前第34頁\共有57頁\編于星期三\15點形成微孔的跨膜肽對脂質體環(huán)境的影響。5_M2-DMPC的構型。MD模擬2ns后。脂質體分子用球和棍表示。頭端的N和P原子用藍色和黃色的球表示。各原子的顏色：M2螺旋的N,藍色；O,紅色；C,灰色；S,黃色。35當前第35頁\共有57頁\編于星期三\15點兩種麻醉劑分子進入雙磷脂層的分配情況。MD模擬2ns后的構型。水分子和SDPC用球棍模型表示，脂質體中的N和P原子表示為藍色和綠色的球。F,黃色；Cl,亮綠色；Br,暗綠色；H,灰色。36當前第36頁\共有57頁\編于星期三\15點離子通道離子通道允許無機金屬離子選擇性地穿過膜脂質層。通過基于原子模型和外部溶劑與膜脂質體之間的微觀相互作用的MD模擬，使我們得以窺探到這類復雜體系的內部過程，允許人們在微觀水平上觀察離子的滲入（透過）。在過去的近十年中，隨著計算方法的改進，短桿菌肽A離子通道的模擬研究從較簡單的僅含有蛋白質和少數(shù)水分子的模型過渡到復雜的含有大的生物分子和脂質體的體系。現(xiàn)在，用真實的原子模型來模擬一些重要的生物通道幾乎是比較常規(guī)的工作，如：Escherichiacoliporin的OmpFporin,機械敏感通道MscL,Streptomyceslividans的KcsAK+通道。37當前第37頁\共有57頁\編于星期三\15點MD模擬中的被2個Na＋離子占據(jù)的短桿菌肽A通道38當前第38頁\共有57頁\編于星期三\15點短桿菌肽A通道在50皮秒時間間隔內沿MD軌跡的5個構形的疊合圖39當前第39頁\共有57頁\編于星期三\15點3幾種常用的預測方法Abinitio

預測不依賴已知結構的同源相似物信息，直接預測一個序列對應的蛋白質三級結構（3D構象）線段模型（Threading）通過研究同已知線段序列的吻合度得到結構信息同源性（Homology）建模根據(jù)序列同源性分析、調整已知結構進行結構預測40當前第40頁\共有57頁\編于星期三\15點比較成功的工具和技術Abinitio

預測Rosetta,RAMPThreading3D-PSSM,PhD,123D

Homology建模Modeller,SWISS-MODEL41當前第41頁\共有57頁\編于星期三\15點幾種abinitio

預測方法分析分子動力學模擬基于格子的方法基于局域模型的方法理論難點：缺少精確的勢能函數(shù)構形空間太大，缺少有效的能量最小化計算策略

42當前第42頁\共有57頁\編于星期三\15點分子動力學模擬優(yōu)點“真正的”abinitio

預測實時的動力學信息良好的理論基礎缺點耗時，計算成本高對大分子溶液中勢函數(shù)的研究不足

43當前第43頁\共有57頁\編于星期三\15點基于格子模型的方法格子模型（Latticemodels）用格子作為蛋白質的建造單位Ising模型離散態(tài)偏離格子模型（DiscreteStateOff-LatticeModels）允許氨基酸擁有有限的運動自由度44當前第44頁\共有57頁\編于星期三\15點基于格子模型的方法優(yōu)點物理圖像簡單降低了計算復雜度缺點無法描述復雜的空間結構分辨率低于格子大小，限制了研究的精確度45當前第45頁\共有57頁\編于星期三\15點基于局域模型的方法局域預測方法（NarrowingthesearchwithLocalStructurePrediction）片段可以獨立地進行折疊折疊的細節(jié)依賴于上下文序列成功應用DavidBaker等的Rosetta46當前第46頁\共有57頁\編于星期三\15點基于局域模型的方法如運用神經(jīng)網(wǎng)絡模型、決策樹模型等機器學習算法來提高計算效率優(yōu)點計算速度快精度高結合了

Homology方法的優(yōu)點缺點非實時信息物理圖像不明顯47當前第47頁\共有57頁\編于星期三\15點通過機器學習提高效率基于神經(jīng)網(wǎng)絡的方法SilvioTosatto等基于決策樹模型的方法ShawnM.Douglas等基于SVM的方法Xu等（PROSPECT）48當前第48頁\共有57頁\編于星期三\15點CASP競賽

CriticalAssessmentofStructurePrediction94年起每兩年進行一次分為三類對已知蛋白質結構進行預測,abinitio,homology,folding,etc.部分自動與全自動方法發(fā)表大量相關信息、評價和展望預測結果逐年得到改進49當前第49頁\共有57頁\編于星期三\15點Rosetta的預測結果

左側為實測結構，右側為預測結構50當前第50頁\共有57頁\編于星期三\15點Rosetta對T0116262-322

的預測結果實際預測51當前第51頁\共有57頁\編于星期三\15點Abinitio

預測發(fā)展趨勢更高的預測精度（大于60%－70%）更加自動化的預測，盡量減少人為的干預與其他方法相結合52當前第52頁\共有57頁\編于星期三\15點4我們的思路－雞尾酒方法

（Semi-abinitio

方法）分子動力學模擬優(yōu)點：實時;良好的理論基礎缺點：計算成本高;精確度不夠高基于模型的方法優(yōu)點：計算速度快;精確度高缺點：不實時;物理圖像不夠明確53當前第53頁\共有57頁\編于星期三\15點Semi-