沉淀反應與凝集反應

沉淀反應與凝集反應第一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗可溶性抗原+相應抗體

肉眼可見的沉淀第二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)液（毒素）與相應抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術(shù)1965年Mancini提出單向免疫擴散技術(shù)，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應達到快速、微量、自動化的新階段。第三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗根據(jù)沉淀反應的介質(zhì)和檢測方法的不同,沉淀反應可分為:

液相內(nèi)的沉淀反應凝膠內(nèi)的沉淀反應第四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗根據(jù)沉淀現(xiàn)象的不同，液體內(nèi)沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀第五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗一、絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗是一項經(jīng)典實驗技術(shù)。曾用于測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉淀的代表試驗，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。第六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(一)原理抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。第七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。第八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應，出現(xiàn)沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結(jié)合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。第九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。第十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗二、環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀(ringprecipitation)試驗是由Ascoli于1902年建立的一種經(jīng)典的血清學定性試驗。用非常簡便的技術(shù)了解待測血清內(nèi)是否存在某種抗原或抗體。第十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細試管液面上。當對應的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。第十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管(內(nèi)徑約1.5~2mm)底部，避免產(chǎn)生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。

3.置沉淀管于室溫下使其反應，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

第十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

該試驗是經(jīng)典的血清學反應之一，簡便、快速、實用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

第十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗三、免疫濁度試驗經(jīng)典的免疫沉淀試驗是抗原和相應抗體在反應終點時判定結(jié)果，方法有耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內(nèi)快速結(jié)合并產(chǎn)生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術(shù)，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。第十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復合物(IC)，當光線透過反應溶液時，由于溶液內(nèi)復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。第十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標準品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。第十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗

3.方法評價

敏感度高于單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內(nèi)、批間重復性較好，變異系數(shù)<10%，操作簡便快速，1h可報告結(jié)果。第十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與復合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。第十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結(jié)合反應過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率法是測定最大反應速率，即在抗原抗體反應達最高峰時，通常為數(shù)十秒鐘，測定其復合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。第二十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內(nèi)，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，于普通坐標紙上繪制標準曲線。根據(jù)待測抗原RU值，查出相應抗原含量。第二十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應達到平衡，大大節(jié)約反應時間，每小時可檢測數(shù)十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水平。第二十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡后，測定其復合物的量。復合物的濁度不再受時間的影響，但反應復合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前(大約反應數(shù)十分鐘)進行濁度測定。第二十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。第二十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

敏感度達mg/L水平，可自動化，但反應時間較長第二十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。第二十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，查出待測抗原量。第二十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應液中無PEC沉淀劑的影響，個體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

第二十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗凝膠內(nèi)沉淀試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。根據(jù)實驗目的與方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗分為3類：①雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmunoelec-trophoresis)。這是一項凝膠內(nèi)電泳加擴散技術(shù)，專門一章介紹。第二十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。第三十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴散，24~48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。第三十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗單向免疫擴散試驗示意圖

第三十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗沉淀環(huán)的直徑與待檢標本內(nèi)含量不是直線關(guān)系，有兩種計算方法：(1)Mancini曲線：適用于大分子抗原，擴散時間>48h，使用普通坐標紙作圖，擴散環(huán)直徑平方和濃度呈線性關(guān)系。(2)Fehcy曲線：適用于分子抗原，擴散時間較短，使用半對數(shù)坐標紙作圖，抗原量的對數(shù)和擴散圈直徑之間呈線性關(guān)系。第三十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗

雙免疫擴散試驗（doubleimmunodiffusion）

雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。第三十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗雙向免疫擴散試驗示意圖第三十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第三節(jié)免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點，一是加快了沉淀反應的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應，以此作更細微的分析。第三十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗免疫電泳包括:

免疫電泳對流免疫電泳火箭電泳免疫印跡等第三十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗一）、免疫電泳

免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴散的結(jié)合。方法是先將樣品加入瓊脂中利用區(qū)帶電泳技術(shù)將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多條弧形沉淀線。第三十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第三十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第四十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗

常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義。第四十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗二）、對流免疫電泳

對流免疫電泳實質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴散技術(shù)，其基本原理是：將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結(jié)果。第四十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗對流電泳示意圖第四十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗三）、火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。第四十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗方法：在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將抗原置陰極端，用橫距2～3mA/cm的電流強度進行電泳?？乖鞠蜿枠O，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。第四十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原第四十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗四）免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western-blot

應用舉例：用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體第四十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離第四十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上第四十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上第五十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上第五十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現(xiàn)第二抗體第五十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗下次課內(nèi)容:

凝集反應時間:2002/3

教員:毛旭虎第五十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗第五十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗凝集反應（agglutination)毛旭虎醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO二年三月第五十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?，當與相應抗體結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團塊，即稱為凝集反應（agglutination）。

第五十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗

1896年，Widal就利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效地診斷傷寒病。

1900年，Landsteriner在特異性血凝現(xiàn)象的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了人ABO血型，并于1930年獲得了諾貝爾獎。

第五十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗凝集反應可分為：

直接凝集反應間接凝集反應第五十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗一）直接凝集反應

細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖?，在適當電解質(zhì)參與下可直接與相應抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應（directagglutination）。凝集反應中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗全稱為凝集素（agglutinin）。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。第五十九頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗玻片法：

ABO血型的鑒定試管法：肥達試驗（Widaltest）---傷寒外斐試驗（Weil-Felixtest）---立克次體第六十頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗二）間接凝集反應

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當大小的顆粒性載體的表面，然后與相應抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應（indirectagglutination）或被動凝集反應（passiveagglutination）。第六十一頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應的方式，間接凝集反應可分為：正向間接凝集試驗反向間接凝集試驗正向間接凝集抑制試驗反向間接凝集抑制試驗第六十二頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗1。正向間接凝集試驗：用抗原致敏載體以檢測標本中的相應抗體第六十三頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗2．反向間接凝集反應

用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應抗原第六十四頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗3．正向間接凝集抑制反應

抗原致敏的顆粒載體及相應的抗體，用于檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。第六十五頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗間接凝集抑制反應原理示意圖A：標本中含抗原B：標本中不含抗原第六十六頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗4．反向間接凝集抑制反應

抗體致敏的顆粒載體及相應的抗原，用于檢測標本中是否存在與致敏抗體相同的抗體。第六十七頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日免疫學及免疫學檢驗在間接凝集反應中，可用作載體的顆粒種類很多，常用的有動物或人紅細胞、細菌和多種惰性顆粒如聚苯乙烯膠乳等。間接血凝試驗是以紅細胞作為載體膠乳凝集試驗是以聚苯乙烯膠乳作為載體協(xié)同凝集反應（coaggoltination）是以一種金黃色葡萄球菌作為載體（它的菌體細胞壁中含有A蛋白（SPA）。SPA具有與IgG的Fc段結(jié)合的特性，因此當這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體。）第六十八頁，共八十頁，編輯于2023年，星期日