基因工程第二章 基因工程的工具酶

第一節(jié)限制性內(nèi)切核酸酶（RestrictionEndonuclease）能專(zhuān)一性識(shí)別雙鏈DNA上的特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)。來(lái)源：細(xì)菌、霉菌和藍(lán)藻功能：細(xì)胞內(nèi)限制性修飾系統(tǒng)的一部分，可以降解“入侵”的外源DNA當(dāng)前第1頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)限制性內(nèi)切酶作為細(xì)菌體內(nèi)保護(hù)自身、避免被噬菌體入侵的作用機(jī)制。當(dāng)前第2頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)一、限制性內(nèi)切酶的命名和種類(lèi)1.命名：生物的屬名的第一個(gè)字母和種名的第一、二個(gè)字母命名，菌株的代號(hào)的一個(gè)字母，和羅馬數(shù)字表示。當(dāng)前第3頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)EcoRIEscherichia屬名Coli種類(lèi)Ry13株系編號(hào)第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株名；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。當(dāng)前第4頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2.限制性內(nèi)切酶的種類(lèi)：平端5′突出粘端3′突出粘端當(dāng)前第5頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)識(shí)別序列：在雙鏈DNA分子能夠識(shí)別的特殊核苷酸序列;一般為4-8bp1）二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱識(shí)別序列（回文序列）當(dāng)前第6頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3.限制酶的特點(diǎn)

1).識(shí)別順序和酶切位點(diǎn)

①識(shí)別４-8個(gè)相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生５’-端突起２）富含ＧＣ當(dāng)前第7頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

３）對(duì)稱性—雙對(duì)稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外

５）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2).

末端種類(lèi)

１）３’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸

EcoRI

5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’當(dāng)前第8頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補(bǔ)的粘性末端ａ）切點(diǎn)在識(shí)別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識(shí)別簡(jiǎn)并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

當(dāng)前第9頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN

上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識(shí)別和酶切，但BamHI和BglII的識(shí)別機(jī)率只有1/16。

BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A

BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識(shí)別和酶切。

BamHI+BglIIA/GGATCT/C

不同末端的連接特性:除第4種末端不能進(jìn)行不同DNA分子或同種DNA分子不同切點(diǎn)產(chǎn)生的末端相連外，其余4種末端可以相互連接。當(dāng)前第10頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4.同尾酶(Isocaudamer)有些來(lái)源不同的限制酶，識(shí)別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)生出相同的粘性末端。MunI：5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新連接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`兩種同裂酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，能否被原來(lái)的限制酶所識(shí)別和切割？當(dāng)前第11頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)5.異源同序酶（Isoschizomer，同裂酶）

1.定義：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶

2.特點(diǎn)：1）識(shí)別相同順序

2）切割位點(diǎn)的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

6.限制酶的星反應(yīng)（Staractivity）

1.

特點(diǎn):限制酶識(shí)別序列特異性降低

2.

發(fā)生星反應(yīng)的限制酶和條件（見(jiàn)下頁(yè)）

3.

星反應(yīng)的利用和避免當(dāng)前第12頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)表1具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件限制酶誘發(fā)星活性的條件a識(shí)別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；

5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亞砜(8%);8:無(wú)NaCl。

當(dāng)前第13頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3.限制性內(nèi)切酶作為基因工程常用工具酶的機(jī)制：當(dāng)前第14頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第15頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3.定向克隆的機(jī)制：當(dāng)前第16頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4.利用噬菌體克隆大片段DNA的機(jī)制：當(dāng)前第17頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第18頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)5.重組DNA片段的檢測(cè)：1）抗藥性篩選當(dāng)前第19頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2）顯色性篩選當(dāng)前第20頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第21頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1.底物DNA：DNA的純度、分子構(gòu)型、識(shí)別序列的側(cè)面序列、位點(diǎn)的偏愛(ài)和DNA甲基化有關(guān)系。2.限制性內(nèi)切酶的用量：酶的活性單位：（U/μl）3.反應(yīng)體系：20μl

DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme：0.5μl

ddH2O：14.5μl二、限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)體系當(dāng)前第22頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4.雙酶切法：DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme1：0.5μl

Enzyme2：0.5μl

ddH2O：14.0μl5.雙酶切注意事項(xiàng)：1）兩個(gè)酶通用緩沖液中的活力；2）用量的控制；當(dāng)前第23頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)6.具體操作時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng)：①整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。②當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，減少酶的用量。③當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液，若沒(méi)有通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)。

當(dāng)前第24頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)限制酶在各種緩沖液中的相對(duì)活性

當(dāng)前第25頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)DoubleDigestion(雙酶切反應(yīng))時(shí)UniversalBuffer(通用緩沖液)的使用表

當(dāng)前第26頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)7.對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行分析

通過(guò)限制性酶切可以得到一定數(shù)量的DNA片斷，DNA帶負(fù)電荷，因此，當(dāng)DNA分子被置于電場(chǎng)中時(shí)它們就會(huì)向陽(yáng)極遷移。這樣就可以通過(guò)凝膠電泳對(duì)酶切DNA片段進(jìn)行分離。當(dāng)前第27頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第28頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第29頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開(kāi)。

完全消化（CompleteDigestion）

12341234當(dāng)前第30頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開(kāi)。通過(guò)縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。

局部消化

123414部分酶切（PartDigestion）當(dāng)前第31頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)第二節(jié)DNA連接酶（DNALigase）

1967年，世界上數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)該酶。2.1基本性質(zhì)：能將兩段DNA拼接起來(lái)的酶，催化DNA相鄰的5‘磷酸基團(tuán)和3’羥基末斷之間形成磷酸二酯鍵，封閉DNA單鏈缺口。當(dāng)前第32頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2.2T4DNA連接酶的作用機(jī)制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3’羥基形成3’,5’-磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。

當(dāng)前第33頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第34頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

8.1.3兩種DNA連接酶比較

T4DNAligaseE.coliDNAligase來(lái)源T4

噬菌體大腸桿菌分子量68kD75kD輔助因子ATPNAD+底物1)雙鏈DNA分子的粘、平端1)同源互補(bǔ)粘端

2)RNA-DNA雜合體、RNA鏈缺口2)雙鏈分子中的單鏈缺口

3)雙鏈DNA分子中的單鏈缺口應(yīng)用范圍廣泛.效率高窄當(dāng)前第35頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)修復(fù)雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵當(dāng)前第36頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)修復(fù)與RNA結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵當(dāng)前第37頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：當(dāng)前第38頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)注意：DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的必須是雙螺旋DNA分子的一部分。當(dāng)前第39頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2.3DNA片段之間的連接2.3.1具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接基本原理：用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端DNA片段。當(dāng)前第40頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2.4具平末端DNA片段之間的連接基本原理：直接用T4DNA連接酶連接.當(dāng)前第41頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2.5DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接1)DNA末端同聚物加尾后進(jìn)行連接基本原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾。當(dāng)前第42頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第43頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2)黏性末端修飾成互補(bǔ)粘端或平末端后進(jìn)行連接基本原理：

采用兩種方法①修平：用核酸酶切除雙鏈DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4連接酶作平末端連接。②補(bǔ)平：用Klenow酶將粘端補(bǔ)平，產(chǎn)生平末端或匹配粘端，再用T4連接酶進(jìn)行連接。當(dāng)前第44頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第45頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

HindIII↓

↓XbaI

5’----ACTAGA----3’

3’----TTCGA

T----5’ dATP dTTPKlenowdGTPdCTPKlenow5’----AAG

CTAGA----3’3’----TTCGA

TCT----5’

T4DNAligase

5’----AAGCTAGA----3’3’----TTCGATCT----5’

圖HindIII,XbaI酶切粘端的補(bǔ)平和連接當(dāng)前第46頁(yè)\共有52頁(yè)\編于