液相色譜培訓(xùn)

液相色譜培訓(xùn)第一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分第二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用

氣相色譜：以氣體作為流動(dòng)相的色譜分離方法適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析流動(dòng)相只起運(yùn)載樣品分子的能力

液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)第三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日HPLC的分離類型正相色譜(NP-HPLC)反相色譜(RP-HPLC)反相離子對(duì)色譜(RPIC)離子交換色譜(IEC)空間排阻色譜(SEC)手性化合物分離模式(Chiralseparationmode)第四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日液相色譜按兩相極性不同分為:正相色譜反相色譜化合物保留時(shí)間隨流動(dòng)相配比的變化不同極性的化合物出峰順序第五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日正相HPLC色譜柱硅膠型

氰基型

氨基型

糖類分析二醇基型蛋白質(zhì)分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi第六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日反相HPLC色譜柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty第七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日

色譜柱

: 非極性溶劑 : 極性水

/甲醇

/乙腈反相色譜第八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理第九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日流動(dòng)相流動(dòng)相選擇注意事項(xiàng)：純度：采用“HPLC”級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配流動(dòng)相配制時(shí)的順序第十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日溶劑等級(jí)水的等級(jí)純化水蒸餾水去離子水波長(zhǎng)(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率第十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶劑等級(jí)鬼峰的出現(xiàn)第十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日溶劑等級(jí)溶劑的等級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45um的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒)優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過0.22um的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫第十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日甲醇乙睛正己烷分析純級(jí)和HPLC級(jí)溶劑的吸光度比較圖溶劑等級(jí)第十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日溶劑前處理過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。過濾膜種類水系過濾膜有機(jī)系過濾膜第十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50μl。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格。處理樣品體積為7μl。樣品過濾頭的類型：第十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。第十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日溶劑前處理

脫氣目的：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個(gè)溶劑所能容納的空氣總量要小氣泡對(duì)測(cè)定的影響：

1）柱壓波動(dòng)，流量偏小

2）基線波動(dòng)

返回第十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日流路中形成氣泡引起的問題

改變保留時(shí)間和峰面積流動(dòng)相中形成氣泡對(duì)液流的不良影響泵中形成氣泡使液流波動(dòng)峰變形柱中氣泡形成和累積使流動(dòng)相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測(cè)池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲第十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日輸液泵輸液泵控制方式：恒流控制恒壓控制輸液泵類型：注射泵柱塞往復(fù)泵隔膜泵第二十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日柱塞往復(fù)泵單向閥馬達(dá)和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭10-100uL第二十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日柱塞往復(fù)泵優(yōu)點(diǎn)壓力脈動(dòng)小易于更換溶劑缺點(diǎn)需要更換柱塞桿密封圈第二十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日島津VP系列輸液泵目的單元流速范圍 特性和應(yīng)用

分析

LC-10ADVP 0.001-9.999 無脈動(dòng)，適于

半微量LC和LC-MS

LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性，適于常量分析*所有單元都既可做高壓梯度又可做低壓梯度第二十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器單一或混合溶劑第二十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日梯度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器B泵AB時(shí)間B

濃度第二十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日分析時(shí)間長(zhǎng)分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脫第二十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日95%30%MeOH濃度梯度洗脫第二十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度注意事項(xiàng)：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）第二十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日混合器低壓梯度比例閥高壓梯度低壓梯度脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)第二十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日返回高壓梯度系統(tǒng)梯度準(zhǔn)確度好系統(tǒng)復(fù)雜(需兩臺(tái)或三臺(tái)泵)低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單需在線脫氣機(jī)存在時(shí)間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)第三十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入返回第三十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日手動(dòng)進(jìn)樣器的原理圖

裝填狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)返回第三十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日進(jìn)樣體積檢測(cè)器響應(yīng)值定量管體積的一半3倍定量管體積全量注入部分注入進(jìn)樣體積與響應(yīng)值關(guān)系返回第三十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測(cè)穩(wěn)定性

柱溫控制的優(yōu)點(diǎn)：第三十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日色譜柱1）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）流動(dòng)相PH使用范圍為2～7.5返回ODS柱的使用注意點(diǎn)：第三十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日流動(dòng)相注意點(diǎn)離子對(duì)試劑的使用具有緩沖鹽流動(dòng)相的使用分析結(jié)束及開始流動(dòng)相平衡加快平衡時(shí)間異丙醇的使用第三十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日LC檢測(cè)器紫外可見檢測(cè)器（UV/VIS）二極管陣列檢測(cè)器（PDA）示差檢測(cè)器（RID）電導(dǎo)檢測(cè)器（CDD）熒光檢測(cè)器（RF）電化學(xué)檢測(cè)器（L-ECD）質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）

第三十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日紫外可見檢測(cè)器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：Lambert-Beer定律，A＝KCL優(yōu)點(diǎn)：1）對(duì)溫度和流速變化不敏感

2）可用于梯度分析缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì)紫外可見檢測(cè)器第三十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日樣品池參比池光電管光電管EinEinEin光柵D2/W燈lEout紫外可見檢測(cè)器第三十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日島津VP系列紫外檢測(cè)器功能1）設(shè)定時(shí)間程序（波長(zhǎng)切換等）2）雙波長(zhǎng)檢測(cè)3）比例色譜，初步判斷峰的純度4）停泵掃描，確定組分最大吸收波長(zhǎng)NEXT第四十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日波長(zhǎng)切換返回第四十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日雙波長(zhǎng)檢測(cè)返回第四十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日比例色譜280nm220nmratio280/220返回第四十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日波長(zhǎng)掃描返回第四十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日二極管陣列檢測(cè)器（SPD－M10AVP）二十一世紀(jì)標(biāo)準(zhǔn)紫外檢測(cè)器色譜信息：保留時(shí)間常規(guī)紫外檢測(cè)器紫外光譜二極管陣列檢測(cè)器第四十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日樣品池二極管陣列（512個(gè)單元）光柵D2/W燈每一單元可檢測(cè)一個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度二極管陣列檢測(cè)器第四十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日三維譜圖時(shí)間波長(zhǎng)吸光度色譜光譜第四十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日二極管陣列檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)1）采集三維譜圖2）峰純度檢驗(yàn)3）光譜庫(kù)檢索NEXT第四十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日峰純度檢驗(yàn)（3點(diǎn)光譜圖比較）InitialdetectionpointFinaldetectionpointT1T3T2peaktopupslopedownslope1/21/3第四十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日乙酰水楊酸下降點(diǎn)上升點(diǎn),頂點(diǎn)峰純度檢驗(yàn)（3點(diǎn)光譜圖比較）返回第五十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日光譜庫(kù)檢索返回第五十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日檢測(cè)器原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率變化以測(cè)定試樣各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器缺點(diǎn)：1）對(duì)溫度和壓力變化敏感

2）不能用于梯度分析示差折光檢測(cè)器返回第五十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日糖的色譜圖AnalyticalConditionsColumn:Shim-packCLC-NH2Mobilephase:Acetonitrile/water=7/3Flowrate:1.0mL/minTemperature:AmbientPeaks1.甘油

2.木糖

3.果糖

4.葡萄糖

5.蔗糖

6.甘露糖

7.乳糖第五十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日熒光檢測(cè)器原理:基于被分析組分發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)缺點(diǎn):僅適用于測(cè)定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)優(yōu)點(diǎn):1)靈敏度極高,是最靈敏的檢測(cè)器之一

2)選擇性