種子的擴大培養(yǎng)

種子的擴大培養(yǎng)第一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

教學目的：了解種子擴大培養(yǎng)的目的和制備過程；掌握優(yōu)良種子應具備的條件；掌握種子制備技術；了解谷氨酸和青霉素生產的種子制備。

教學重點、難點：發(fā)酵級數(shù)的確定及對發(fā)酵的影響；接種量的確定及對發(fā)酵的影響；影響種子質量的因素及其控制措施。第四節(jié)種子的擴大培養(yǎng)（2學時）第二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日種子的擴大培養(yǎng)1制備過程2實驗室階段3生產車間階段4種子質量控制

內容速覽4.2種子制備技術概要4.1目的與要求4.3種子制備過程舉例第三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日種子擴大培養(yǎng)的目的:

□接種量的需要

□縮短發(fā)酵時間、提高發(fā)酵效率需要數(shù)量多、代謝旺盛、活力強的種子接入發(fā)酵罐中。

□菌種的馴化一種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的概念:

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量和質量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日優(yōu)良種子應具備的條件：

菌體濃度及總量能滿足大規(guī)模發(fā)酵罐接種量的要求；

生理狀態(tài)穩(wěn)定，如菌絲形態(tài)、菌絲生長速率等；

生長活力強，移種至發(fā)酵罐后，能夠迅速生長；

無雜菌污染，保證純種發(fā)酵；

菌種適應性強，能保持穩(wěn)定的生產能力。

返回第五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日二種子制備技術概要（一）種子制備的過程1－砂土孢子2—冷凍干燥孢子3－斜面孢子

4—搖瓶液體培養(yǎng)5—茄子瓶斜面培養(yǎng)

6—固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7、8—種子罐培養(yǎng)9—發(fā)酵罐

返回第六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日（二）實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴培到一定的量和質。

根據菌種的特點最終的培養(yǎng)物可分為兩類：實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此形象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段。第七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

對于不產孢子的微生物，實驗室階段的種子擴培最終是獲得一定數(shù)量和質量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。三角瓶搖床培養(yǎng)第八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

對于產孢子的微生物

獲得一定數(shù)量和質量的菌絲體：對于產孢子能力不強及孢子發(fā)芽慢的菌種，可以采用搖瓶液體培養(yǎng)法，經恒溫振蕩培養(yǎng)獲得菌絲體。

獲得一定數(shù)量和質量的孢子：對于產孢子能力強及孢子發(fā)芽、生長迅速的菌種可采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，所獲孢子可直接作為種子罐的種子。第九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

孢子的制備①細菌孢子的制備◆斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方?！襞囵B(yǎng)溫度：一般為37?C，少數(shù)28?C。

◆培養(yǎng)時間：需要5～10天。

②霉菌孢子的制備

一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養(yǎng)基。

培養(yǎng)的溫度：一般為25～28?C。

培養(yǎng)時間：4～14天。第十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日③放線菌孢子的制備◆一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等，C、N不要太豐富（碳源約為

1%，氮源不超過0.5%）?！襞囵B(yǎng)溫度：大多數(shù)為28?C，少數(shù)37?C?！襞囵B(yǎng)時間：5～14天。第十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。e.g產黃青霉菌第十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日對于不產孢子的赤霉素生產菌（Gibberellinefujikuroi），也可用大米固體培養(yǎng)基在茄子瓶中培養(yǎng)菌絲體，用作種子罐種子。不產孢子的細菌，如生產谷氨酸的棒狀桿菌（Corynebacterium）、短桿菌（Brevibacterium），生產上一般采用斜面營養(yǎng)細胞進行擴培，再轉入液體搖瓶培養(yǎng)，獲得細胞懸液再接種。第十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生產菌）原始菌種（出發(fā)菌種）固體試管斜面（32°C，18~24小時）

三角瓶培養(yǎng)（搖床）(flaskculture)

種子罐培養(yǎng)

e.g.

yeast：原始菌種（出發(fā)菌種）10ml麥汁試管250ml三角瓶培養(yǎng)（27°C~28°C，3天）（25°C，2天）

5~10L卡氏罐（15°C~20°C，3~5天）第十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日2、培養(yǎng)基選擇的原則

培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。

在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。

返回第十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日（三）生產車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。菌絲體比孢子要有利：縮短發(fā)酵時間有利于獲得好的發(fā)酵結果

生產車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，在工廠一般歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產車間階段。第十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:一是成本、二是馴化。第十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日3、發(fā)酵級數(shù)的確定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵（二級種子罐擴大培養(yǎng)）一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。第十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日發(fā)酵級數(shù)確定的依據：

級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響；

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2～4級；

在發(fā)酵產品的生產中，反應級數(shù)的確定是非常重要的一個方面。第二十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日采用三級種子的谷氨酸發(fā)酵工藝

李文東，發(fā)酵科技通訊，2003,7斜面→一級種子（1200ml/5000ml三角瓶）→二級種子（2m3）→三級種子（20m3)→發(fā)酵罐（240m3)

背景：近年來，由于谷氨酸發(fā)酵產酸水平快速提高，發(fā)酵工藝也在不斷改進和創(chuàng)新，國內大多數(shù)廠家都采用“大種量二級種子發(fā)酵工藝”（種子罐是發(fā)酵罐的5%以上）

，發(fā)酵產酸水平和糖酸轉化率比“小種量二級種子發(fā)酵工藝”（種子罐是發(fā)酵罐的1%左右）有了較大提高。但是生產水平和糖酸轉化率穩(wěn)定性較差，發(fā)酵平均周期35h左右，沒有達到提高設備利用率和降低生產成本的目的。文章：三級種子工藝第二十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日①種量更大，生長速度更快，產酸提前且速度快：工藝8小時產酸（%）12小時產酸（%）發(fā)酵周期（h)三級種子2.2～2.74.6～5.232大種量二級種子1.0～1.52.6～3.435②糖酸轉化率高且穩(wěn)定工藝產酸（%）糖酸轉化率（%）單罐產量(噸）三級種子10.9359.821二級種子9.85818三級種子的特點：第二十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日4、接種量的確定接種量指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積之比。接種量大小取決于生產菌種的生長繁殖速度。過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7～15%，而由北京棒狀桿菌發(fā)酵谷氨酸只需1%。

第二十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日一般認為大一點好。采用較大的接種量可縮短菌絲體繁殖達到高峰的時間，使產物形成提前到來；生產菌占優(yōu)勢，減少雜菌生長的機會。接種量過多，往往又會使菌絲生長過快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足，而影響產物的合成。接種量過小，引起發(fā)酵前期菌體生長緩慢，使發(fā)酵周期延長，菌絲量少，產生菌絲團，導致發(fā)酵異常等4、接種量的確定第二十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

近年來，生產多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產的措施。有的產品采用雙種法：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中，如卡那霉素生產中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高8%；也有的采用倒種法：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐中發(fā)酵液，如鏈霉素發(fā)酵中，使用倒種比單種發(fā)酵單位提高12%。

4、接種量的確定第二十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日接種量對菌體形態(tài)和產Υ亞麻酸的影響楊博，中國油脂，2002

Υ亞麻酸是一種人體必需多價不飽和脂肪酸，它是人體前列腺素的前體物質，在預防與治療心腦血管疾病、糖尿病治療、增強免疫力、抗癌和保護皮膚等方面具有重要的生理功能。因發(fā)酵法生產Υ亞麻酸與從天然植物提取相比具有一系列優(yōu)點，發(fā)酵法生產Υ亞麻酸成了當今研究的一個熱點。

Υ亞麻酸發(fā)酵一般是采用絲狀真菌來進行，絲狀真菌的形態(tài)往往對發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵Υ亞麻酸時菌絲體形態(tài)的不同對發(fā)酵的影響很少有報道。第二十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體第二十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日第二十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進行Υ亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產量。種子的擴大培養(yǎng)第二十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日5、種齡(seedage)

種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。

種齡年輕：接入發(fā)酵罐后，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、整個發(fā)酵周期延長、產物開始形成的時間推遲，甚至出現(xiàn)發(fā)酵異常情況；

種齡過老：引起生產能力下降而菌絲過早自溶。

原則：一般以處于對數(shù)生長期的菌絲體較為合適，細胞活力強，菌體濃度相對較大。具體需實驗確定。第三十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日舒琴，林產化學與工業(yè)，2004

菌種為嗜堿性芽孢桿菌鏡檢：24小時多個桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期，30小時開始出現(xiàn)芽孢

返回第三十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日（四）種子質量控制1、種子質量標準2、影響種子質量的因素3、種子質量的控制措施４、種子質量異常分析第三十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日①生化指標②檢查菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色澤、氣味、渾濁度等）③檢查有無雜菌污染④產物生成量⑤其他參數(shù)

1、種子質量標準第三十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日檢測培養(yǎng)液中的糖氨基氮磷酸鹽含量:萃取-磷鉬藍比色法

pH值①生化指標3，5-二硝基水楊酸法斐林試劑法第三十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日色澤、氣味、渾濁度等

單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；

霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況好。

②檢查菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀第三十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日纈霉素發(fā)酵液中氨基氮的測定氨基酸中的-NH3+基的pk值常在9.0以上，不能用一般的酸堿指示劑（包括酚酞），以氫氧化鈉溶液作滴定測量。但可以用甲醛滴定法測量。在pH中性和常溫條件下，甲醛迅速與氨基酸中氨基相互作用，使滴定終點移至pH9.0左右，在該過程中指示劑酚酞不與甲醛作用。pH9.0正是酚酞的變色范圍，因此，可以用酚酞作為指示劑，以氫氧化鈉溶液來滴定-NH3+基上的H+，每釋放一個氫離子，就相當于一個氨基酸。第三十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日反應如下R-NH3+H++R-NH2R-NH2+2CH3CHOR-N(CH2OH)2第三十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日實驗步驟1.將發(fā)酵液過濾，取濾液2.5mL于250mL三角瓶中，加蒸餾水約50mL,加甲基紅指示劑2~3滴，加1mol/LHCl溶液1～2滴，使成紅色，放置3min.2.以標準NaOH溶液滴定至剛好轉橙黃色，讀取此時滴定管刻度，加入12％中性甲醛10mL，放置5—10min。3.加入酚酞指示劑1mL，用標準NaOH溶液滴定至呈微紅色為終點，讀取此時滴定管刻度。兩次讀數(shù)之差即為所耗NaOH毫升數(shù)。第三十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日結果計算

NNaOH×VNaOH×14.01NH-N%=×1002.5單位：mg/100ml

第三十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日④產物生成量如，在抗生素發(fā)酵中，產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。⑤其他參數(shù)：如某些酶的活力、種子罐的溶氧和尾氣等。

eg,土霉素生產的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關系。

③檢查有無雜菌污染第四十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日④產物生成量如，在抗生素發(fā)酵中，產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。⑤其他參數(shù)：如某些酶的活力、種子罐的溶氧和尾氣等。

eg,土霉素生產的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關系。

③檢查有無雜菌污染第四十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日2、影響種子質量的因素①原材料質量②種齡

③培養(yǎng)條件④斜面冷藏時間2、影響種子質量的因素第四十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日2、影響種子質量的因素

生產過程中經常會出現(xiàn)種子質量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質量波動：產地、品種、加工方法等。

e.g1：四環(huán)素、土霉素斜面用麩皮：小麥產地、品種、加工方法及用量影響孢子的質量。

e.g2：蛋白胨：有魚胨、骨胨、胰蛋白胨。瓊脂、水無機離子差別引起孢子質量變化，微量Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。①原材料質量第四十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日2、影響種子質量的因素②種齡

種齡過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長以及因菌體量過少而菌絲結團，引起異常發(fā)酵等等；

種齡過老的種子接入發(fā)酵罐后，則會因菌體老化而導致生產能力衰退。一般以對數(shù)生長期為好。

第四十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

③培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度過低會導致菌種生長發(fā)育緩慢，過高會使菌種過早自溶。如果不是用最適溫度培養(yǎng)，其生產能力就會下降。

選擇最適種子培養(yǎng)pH；最后一級種子的培養(yǎng)基pH應接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應新的環(huán)境。

通氣與攪拌（aerationandagitation

足夠的通氣量可提高種子質量；攪拌可以提高通氣效果，如果攪拌效果不好、攪拌時泡沫過多會使菌絲黏壁，甚至菌絲結團，影響種子質量。此外，絲狀真菌，一般不宜劇烈攪拌。2、影響種子質量的因素第四十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日濕度：斜面培養(yǎng)基的濕度對孢子的質量有較大影響，濕度低孢子生長快，濕度高孢子生長慢。在南方相對濕度控制在35％～42％。孢子數(shù)量最多，孢子顏色均勻，質量較好。如土霉素生產菌種龜裂霉菌的孢子，在北方干燥地區(qū)孢子斜面長的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢子長的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。

③培養(yǎng)條件第四十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

對孢子的生產能力有較大的影響，通常冷藏時間越長，生產能力下降越多。

土霉素菌種孢子斜面培養(yǎng)四天左右，即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體自溶，而培養(yǎng)五天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。鏈霉素發(fā)酵中，斜面孢子在6℃冷藏2個月后發(fā)酵單位比冷藏1個月的降低18%。④斜面冷藏時間第四十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日3、種子質量的控制措施

種子質量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產能力，所以必須保證：①菌種的穩(wěn)定性；②提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境；③無雜菌侵入。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查定期考查和挑選菌種，對其進行自然分離，搖瓶發(fā)酵，測定生產能力，以不低于原有的生產能力為原則，從中挑選出高產菌株，并及時對退化菌種進行復壯。第四十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日

確保菌種能在適宜的條件下生長繁殖，包括營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基、適宜的培養(yǎng)溫度、pH和濕度、合理的通氣量等。（3）種子無雜菌檢查種子在制備過程中每一步移種均需進行無雜菌檢查，并對種子液進行生化分析：主要是取樣測定其營養(yǎng)消耗速度、pH變化、溶解氧利用情況、色澤和氣味等。

無菌檢查是判斷雜菌的主要依據，通常采用鏡檢和無菌試驗相結合。（2）適宜的生長環(huán)境第四十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日４、種子質量異常分析●菌種生長過慢或過快：與孢子質量及種子罐的培養(yǎng)條件有關。通入種子罐的無菌空氣的溫度較低或者培養(yǎng)基的滅菌質量較差是種子生長、代謝緩慢的主要原因。

●菌絲結團：與攪拌效果差，接種量小有關。菌絲結團會影響菌的呼吸和對營養(yǎng)物質的吸收。

●菌絲粘壁：與攪拌效果不好，泡沫過多，以及種子罐裝料系數(shù)過小等原因有關。其結果使培養(yǎng)液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團。

返回第五十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期日三

種子制備過程舉例（一）谷氨酸生產的種子制備制備過程斜面種子→搖瓶種子（一級種子）→種子罐種子（二級種子）