分子生物學(xué)教學(xué)課件：分子生物學(xué)實驗-實驗操作

重組人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的構(gòu)建分子生物學(xué)實驗-實驗操作基因、載體、受體菌株基因載體菌株質(zhì)粒酶切連接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取PCR實驗技術(shù)要求應(yīng)掌握的實驗技術(shù)酶切,連接凝膠回收制備感受態(tài)細胞質(zhì)粒提取PCR瓊脂糖凝膠電泳考察指標電泳、藍白斑數(shù)量電泳感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率電泳電泳電泳實驗流程:第一天8AM-5PM

（重組載體構(gòu)建）rhIL-18基因的PCR產(chǎn)物載體質(zhì)粒pUC18BglⅡ和PstⅠ雙酶切BamHⅠ和PstⅠ雙酶切濃度1%瓊脂糖凝膠電泳凝膠回收純化電泳檢驗T4連接酶連接過夜配制LB液體與固體平板培養(yǎng)基滅菌37℃過夜培養(yǎng)TOP10菌株溶液回收純化實驗流程:第二天8AM-5PM

（重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞）CaCl2法制備E.Coli

JM109感受態(tài)細胞實驗組連接體系42℃熱激轉(zhuǎn)化90s37℃溫柔孵育45min涂布平板37℃過夜倒置培養(yǎng)實驗流程:第三天1PM-5PM

（陽性轉(zhuǎn)化子鑒別及轉(zhuǎn)化效率檢驗）觀察陰性對照組菌落生長情況有無菌落挑取1白色單菌落37℃液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)觀察陽性對照組菌落生長情況統(tǒng)計菌落數(shù)量計算感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率觀察實驗組菌落生長情況統(tǒng)計藍斑，白斑菌落數(shù)量觀察空菌對照組菌落生長情況統(tǒng)計菌落數(shù)量觀察空菌對照組菌落生長情況統(tǒng)計菌落數(shù)量第5組Ampc+第4組Ampc-實驗流程:第四天8AM-5PM

（含有目的基因重組載體的鑒定）提取質(zhì)粒DNAPCR濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物濃度1%瓊脂糖凝膠電泳BamHIPstIBglIIPst

I重組載體HybridsitePst

IBglIIPst

IrhIL-18BamHIPst

IpUC18BamH

I/

PstIBglII

/

PstIligation重組載體構(gòu)建流程HybridsiterhIL-18的PCR（1）反應(yīng)體系TemplateDNA2.0ul10×buffer5.0ulMgCl2（25mmol/L）6.0ulprimer1（25umol/L）1.0ulprimer2（25umol/L）1.0uldNTP（2mmol/L）4.0ulTaq酶（5u/uL）1.0ul滅菌超純水補齊至50ul引物IL-B：ATGTCAAGATCTTACTTCGGTAAACTGGAATCTAAACTGTCTGIL-P：TGACATCTGCAGTCACTAGTCTTCGTTCTGAACGGTGAACATG

（2）PCR擴增條件：94℃4min94℃30S55℃30S30個循環(huán)72℃60S72℃10min4℃—∞雙酶切反應(yīng)（20μL體系）rhIL-18的PCR產(chǎn)物目的基因6.8μLBufferO2μL無菌水9.2μLBSA(2mg/ml)

1.0μLBglⅡ0.5μLPstⅠ0.5μL質(zhì)粒pUC18質(zhì)粒(PUC-18)10μL10×BamHⅠBuffer2μL無菌水6.4μLBamHⅠ(5u/ul)0.6μLPstⅠ

1μL37℃酶切反應(yīng)3小時。培養(yǎng)基配制LB液體培養(yǎng)基每1L配量：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化鈉5g滴加5NNaOH（約0.2mL），調(diào)節(jié)pH值至7.0

LB固體培養(yǎng)基:每100ml液體培養(yǎng)基添加1.5g瓊脂每組準備：3個30ml液體培養(yǎng)基120ml固體培養(yǎng)基滅菌5個培養(yǎng)皿3個30mlLB液體培養(yǎng)基1個120mlLB固體培養(yǎng)基一個50ml離心筒微量移液器頭(槍頭)和EP管瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。

DNA的分子大小瓊脂糖濃度

DNA分子的構(gòu)象電源電壓

嵌入染料的存在

離子強度影響瓊脂糖凝膠制作圖示瓊脂糖凝膠的配制稱取0.3g瓊脂糖，加入30ml1×TAE緩沖液，于微波爐中加熱沸騰3次。取出稍冷后加入5μL基因染料，混勻。將凝膠倒入調(diào)平的凝膠板上，插入梳子。冷卻。瓊脂糖凝膠回收瓊脂糖凝膠電泳檢驗，回收酶切產(chǎn)物：使用柱式凝膠回收試劑盒分別對：

目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收載體片段（2.7Kb片段）進行凝膠回收1.將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離心管中，稱取重量。2.向膠塊中加入3倍體積溶液GSB（如凝膠重為100mg，其體積可視為100μL，依此類推）。55℃水浴放置6–10min，間斷(2-3min)溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊溶解（若膠塊的體積過大，可事先將膠塊切成碎塊）。（將目的基因體積補至100μL，由此補平行操作。）注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合DNA的能力較弱。瓊脂糖凝膠回收

3.將上一步所得溶液加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1min，10,000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。注意：吸附柱容積為800μL，若樣品體積大于800μL可分批加入。4.向吸附柱中加入650μL溶液WB，10,000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。5.將吸附柱放回收集管中，10,000rpm離心1-2min，盡量除盡殘留的溶液WB。注意：溶液WB中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。6.將吸附柱置于一個干凈離心管中,開蓋靜置1min

，使殘留乙醇揮發(fā)干凈。向吸附膜中間位置懸空滴加20μL溶液EB或去離子水(EB或去離子水在60-70度水浴預(yù)熱,使用效果更好)，室溫靜置1min。

7.

10,000rpm離心1min,收集DNA溶液。平板鋪制取出滅菌后的固體培養(yǎng)基先鋪制一個平板(不含Amp、IPTG、X-Gal)留作空菌對照。每100ml瓶培養(yǎng)基中加入：IPTG100ulX-Gal200ulAmp100ul

再鋪制4個平板連接反應(yīng)⑴在滅菌的0.2mL離心管（PCR管）中進行

⑵15μL體積反應(yīng)體系中：

10×快速連接緩沖液1.5μL

rhIL-18雙酶切產(chǎn)物XμL

質(zhì)粒pUC18雙酶切產(chǎn)物YμLT4-DNA連接酶0.7μL

加水補足15μL１６℃連接過夜．酶切產(chǎn)物比例換算連接反應(yīng)中目的基因：質(zhì)粒=3：1連接反應(yīng)體系中加入目的基因和質(zhì)粒酶切片斷的體積比=基因的亮度基因的堿基數(shù)：質(zhì)粒的亮度質(zhì)粒的堿基數(shù)基因的摩爾質(zhì)粒的摩爾：=基因的體積質(zhì)粒的體積：3×基因的堿基數(shù)×質(zhì)粒的亮度基因的亮度×質(zhì)粒的堿基數(shù)感受態(tài)菌的制備（1）Top10菌株37℃過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液0.6mL加入到30mLLB培養(yǎng)基中，37℃，230r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4左右(約2h)。（2）無菌條件下，將30mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。（3）在預(yù)冷4℃的離心機上以4000r/min離心10min，棄去上清，加入20mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃離心10min，棄去上清，每30mL初始培養(yǎng)物用1.0mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細胞沉淀，200μL/管分裝。pUC18-hIL-18重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）向分裝有200μLE.coliTOP10菌株感受態(tài)細胞的EP管中加入10μL的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30min實驗組1Ampc+涂100μL轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌 實驗組2Ampc+涂200μL轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌陽性對照Ampc+(涂100μL)10μLpUC18（濃度0.05μg/μL）陰性對照1Ampc+感受態(tài)細胞(涂100μL)陰性對照2Ampc-感受態(tài)細胞(涂100μL)（2）將該EP管放入預(yù)加溫至42℃的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1~2min。（3）向EP管加入800μLLB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37℃搖床上，150r/min，溫育45min以復(fù)蘇菌株。（4）將200μL上述培養(yǎng)物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細胞平鋪于瓊脂平板表面。（5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養(yǎng)；感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的計算轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝陽性對照菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)感受態(tài)細胞總數(shù)＝空菌對照菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù)柱式質(zhì)粒小量抽提1.取1-5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清。2.向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或漩渦振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。3.向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片段。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變清亮，可能由于菌體過多，裂解不夠徹底，應(yīng)減少菌體量。4.向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。5.將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），盡量不要吸出沉淀。12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。6.向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液WB，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。7.向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液WB，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液。8.將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm離心2min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。9.將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加40μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12,000rpm離心1min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。PCR鑒定陽性克隆原理PCR鑒定1、調(diào)整模板（待鑒定質(zhì)粒）濃度至5ng/μL2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，TemplateDNA

1.0μLM13PrimerM4(10μmol/L)

1.0μLM13PrimerRV(10μmol/L)

1.0μLddH2O7.0μL2×TaqPCRma