第五講胚胎工程

第五講胚胎工程第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一基本內(nèi)容超數(shù)排卵、胚胎培養(yǎng)、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、性別鑒定、胚胎嵌合、細(xì)胞核移植、體外受精、基因?qū)胍约芭咛ジ杉?xì)胞第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

超數(shù)排卵超數(shù)排卵是一種不正常的排卵，經(jīng)外源激素處理的雌性動(dòng)物，改變其性周期，使之按照預(yù)定時(shí)間超常量的排卵。1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只兔取得胚胎88枚，有1只金黃地鼠采得72枚胚胎第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一超數(shù)排卵的生理基礎(chǔ)第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一促卵泡激素(FSH)FSH為糖蛋白激素，由α、β兩個(gè)亞單位結(jié)合，β亞單位是決定生物活性的其生物功能是刺激卵巢中卵泡成熟并分泌雌激素。第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一促黃體激素(LH)也稱促間質(zhì)細(xì)胞激素(ICSH)，為糖蛋白質(zhì)激素.LH的α和β兩個(gè)亞單位相互結(jié)合在一起時(shí)，才具有強(qiáng)的生物活性。LH所特有的生物作用是由β亞單位決定的它的生物功能是激發(fā)排卵，促使黃體從萎縮破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素。第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一孕馬血清促性腺激素(PMSG)這是一種比較特殊的促性腺激素，是一種糖蛋白結(jié)構(gòu)PMSG分子，包含α和β亞單位，β亞單位是體現(xiàn)生物活性的功能團(tuán)。在活體中，PMSG的半存留期，比垂體和其他胎盤促性腺激素要長(zhǎng)。PMSG的β亞單位只能和PMSG的α亞單位結(jié)合；但是，PMSG的α亞單位可以和FSH的β亞單位、LH的β亞單位及HCG的β亞單位結(jié)合，而且使這幾種β亞單位都具有生物活性。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一人絨毛膜促性腺激素(HCG)是人胎盤分泌的一種糖蛋白激素。HCG分子包含α和β亞單位。受精卵著床的第1天，孕體的滋養(yǎng)層細(xì)胞開始分泌HCG，孕后10d左右在尿中和血中都可以查出來。有人把HCG叫做全身激素，胎兒的HCG遺傳密碼能產(chǎn)生大量HCG，而成年人各組織和多種癌細(xì)胞也能產(chǎn)生HCG。但是只有胎盤的HCG是經(jīng)滋養(yǎng)糖基化的糖蛋白質(zhì)激素，這樣的HCG才具有生物活性。HCG分子中的α和β亞單位一定是結(jié)合的形式，β亞單位才能夠體現(xiàn)出生物活性，生物活性的強(qiáng)弱是β亞單位上的唾液酸含量決定的。HCG的生理作用是多方面的，這里主要是它促卵泡發(fā)育并排卵的作用，增大超數(shù)排卵的效果。第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一超數(shù)排卵的影響因素動(dòng)物遺傳特性、體況、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、年齡、發(fā)情周期的階段、卵巢的功能狀態(tài)、季節(jié)、溫度激素的品種與用量第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎培養(yǎng)二十世紀(jì)30年代Nicholas和Rudnik就開始對(duì)嚙齒動(dòng)物胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)并獲得成功。嚙齒類動(dòng)物著床后胚胎培養(yǎng)(WEC)不僅被胚胎學(xué)家運(yùn)用于胚胎正常發(fā)育的研究，而且其在環(huán)境致畸物的篩檢及致畸機(jī)理研究中的應(yīng)用亦愈來愈受到人們的重視。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎保存超低溫長(zhǎng)期凍存胚胎具有較強(qiáng)的實(shí)際意義。它能夠使優(yōu)秀品種品系(包括珍稀和瀕危動(dòng)物)的種質(zhì)得到長(zhǎng)期保存下來，逐步地將生物界的所有生命基因都長(zhǎng)期保存起來，防止基因丟失，并且可以隨時(shí)復(fù)蘇、繁殖品系動(dòng)物，在遺傳理論指導(dǎo)下，可改良品種和培育新品種及品系，推動(dòng)生命科學(xué)蓬勃發(fā)展。胚胎的低溫保存不但安全可靠，而且可以減少大量的空間和財(cái)力上的支出，因此它是目前實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源保存的最為有效的方法。世界上一些發(fā)達(dá)國(guó)家以此方法建立起了各自的包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在內(nèi)的胚胎庫，目前我國(guó)國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心和上海分中心等單位正在開展胚胎和配合子低溫保存的研究。第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎保存的方法緩慢降溫法玻璃化低溫保存法。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一兩種方法的比較兩種方法最大的不同點(diǎn)在于緩慢冷凍方法可靠安全，但需要特殊的儀器設(shè)備(程序降溫儀等)，該方法適用于大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位和保種單位；而玻璃化低溫保存則對(duì)設(shè)備要求相當(dāng)?shù)停谄占?，適用于保存一些特殊品系且數(shù)量較少的單位。第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎嵌合將動(dòng)物品系內(nèi)、種內(nèi)、種間或?qū)匍g的兩個(gè)或多個(gè)胚胎以聚合或注入等方法嵌合在一起培養(yǎng)，使之發(fā)育成為一個(gè)胚胎，稱為嵌合胚胎。再將該胚胎移植給受體，發(fā)育成個(gè)體。如該動(dòng)物具有兩種以上動(dòng)物胚胎的細(xì)胞則稱之為嵌合體動(dòng)物，如同類黑鼠和白鼠胚胎嵌合，生下黑白相間的花小鼠。目前嵌合體動(dòng)物有小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬和牛等；種間嵌合體動(dòng)物有大鼠-小鼠嵌合體，綿羊-山羊嵌合體，馬-斑馬嵌合體，牛-水牛嵌合體等。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一嵌合體技術(shù)

動(dòng)物胚胎嵌合技術(shù)即通過顯微操作，使2枚或2枚以上受精卵(胚胎)的全部或部分胚胎細(xì)胞嵌合在一起，人工復(fù)合胚胎，以獲得嵌合體動(dòng)物的技術(shù)。主要有聚合法和注射法兩種。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一BALB/C-C57胚胎嵌合體小鼠

第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一聚合法一般是把8細(xì)胞至桑椹胚前期的胚胎去掉透明帶后，將兩個(gè)胚胎的卵裂球聚合在一起，形成一個(gè)胚胎，經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)育至囊胚階段，再移植給受體。對(duì)于移植前需要透明帶的動(dòng)物，用8細(xì)胞至桑椹胚前期的胚胎制作種間或異種嵌合體時(shí)，將供、受體胚胎去透明帶后，將卵裂球分裂，各取一半放入一方透明帶內(nèi)，用PHA使之聚合并包埋瓊脂，然后移植到該種動(dòng)物輸卵管內(nèi)使之發(fā)育至囊胚再移植，或體外培養(yǎng)發(fā)育至囊胚再移植給受體。第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一注射法是把細(xì)胞注入到囊胚腔內(nèi)。注射用細(xì)胞可以是卵裂球，也可以是發(fā)育后期胚胎細(xì)胞，甚至可以是畸胎瘤細(xì)胞和ES細(xì)胞。第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一嵌合體技術(shù)應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用領(lǐng)域，嵌合體技術(shù)主要應(yīng)用于人類遺傳疾病動(dòng)物模型的研究，如人唐氏綜合征、神經(jīng)管不全、白血病等均通過嵌合體方法建立了動(dòng)物模型；結(jié)合ES細(xì)胞和基因?qū)耄偻ㄟ^嵌合體方法建立遺傳病動(dòng)物模型，以尋求治療方法。此外，嵌合體可應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如作為發(fā)育生物學(xué)的研究材第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

胚胎分割

通過對(duì)胚胎的顯微操作,人工制造同卵雙胞胎或多胞胎的技術(shù)，胚胎分割是哺乳動(dòng)物胚胎工程的重要組成部分。其操作有兩種方式，一種是在8細(xì)胞階段以前，將每個(gè)卵裂球(2-4細(xì)胞階段)或兩個(gè)卵裂球(4或8細(xì)胞階段)作為一組，分別放入一個(gè)空的透明帶內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成一個(gè)胚胎；另一種方式是對(duì)桑椹胚至囊胚期的胚胎進(jìn)行分割，然后把每一份放入一個(gè)空的透明帶內(nèi)。經(jīng)過培養(yǎng)再移植，或者將一個(gè)具有幾個(gè)卵裂球的胚胎，用機(jī)械或化學(xué)的方法使卵裂球分開，對(duì)每一個(gè)卵裂球進(jìn)行培養(yǎng)，使其再分裂變成一個(gè)可移植的胚胎。第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎分割技術(shù)應(yīng)用可以與其他胚胎生物技術(shù)相結(jié)合，為胚胎轉(zhuǎn)基因技術(shù)、性別鑒定技術(shù)提供活胚檢查的方法，為胚胎嵌合、胚胎干細(xì)胞技術(shù)提供卵裂球分離的方法和手段，胚胎分割還可以獲得遺傳上同質(zhì)的后代。第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一核移植(nucleartransplantation，NT)就是將動(dòng)物早期胚胎卵裂球或動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的(同種或異種)受精卵或成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)中，從而獲得重構(gòu)卵，并使其恢復(fù)細(xì)胞分裂，繼續(xù)發(fā)育為與供體細(xì)胞基因型完全相同的后代的技術(shù)。核移植技術(shù)最早由德國(guó)胚胎學(xué)家Spemann于1938年首次提出，是為了研究細(xì)胞核的全能性和發(fā)育過程中細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系而建立的。早期的研究工作主要集中在兩棲類和魚類；哺乳動(dòng)物的核移植研究始于1969年，但由于其卵母細(xì)胞較小而且是體內(nèi)發(fā)育，給研究工作帶來一定難度，直到1983年McGrath等建立了一套較為適用的方法并成功地獲得了克隆小鼠。第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一核移植技術(shù)的程序供體細(xì)胞培養(yǎng)；卵母細(xì)胞的體外成熟、去核；細(xì)胞核移植、融合、激活；重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和胚胎移植；任何一步不理想,都會(huì)影響到克隆胚胎或動(dòng)物的發(fā)育。第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一現(xiàn)代核移植技術(shù)已由早期研究細(xì)胞分化中遺傳物質(zhì)所起的作用，即研究核質(zhì)互作問題，擴(kuò)展到轉(zhuǎn)基因、基因打靶等方面；并成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物擴(kuò)繁和瀕危動(dòng)物物種保護(hù)的一種有效的技術(shù)。核移植是實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物無性繁殖的重要手段，能產(chǎn)生遺傳特性一致的動(dòng)物群，是培育超純系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的新途徑和有效方法。胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)要比胚胎分割技術(shù)進(jìn)了一步，它是用顯微手術(shù)的方法分離未著床的早期胚胎細(xì)胞，將其單個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入去除染色體的未受精的成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)過電融合，讓該卵母細(xì)胞質(zhì)和導(dǎo)入的胚胎細(xì)胞核融合、分裂、發(fā)育成胚胎。把該胚胎移植給受體，讓其妊娠產(chǎn)仔。目前知道的胚胎細(xì)胞核移植克隆的動(dòng)物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴子等。核移植技術(shù)在研究?jī)蓚€(gè)原核的作用，核質(zhì)關(guān)系和加速繁殖優(yōu)良實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面，將起著巨大的作用。第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一體外受精(invitrofertilization,IVF)體外受精技術(shù)是指通過人工操作使精子和卵子在體外環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，主要用于培育試管動(dòng)物。體外受精技術(shù)為遺傳播種提供了新的選擇，因?yàn)榕c體內(nèi)受精相比對(duì)正常精子的需求很少，從而提高了具有性特征的精子利用率的可能性。第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎移植胚胎移植是將動(dòng)物的受精卵或發(fā)育數(shù)日的胚胎,從某一個(gè)體(供體)移植到同種動(dòng)物的另一個(gè)體（受體），使之繼續(xù)發(fā)育的技術(shù)，亦稱受精卵移植或卵移植。經(jīng)胚胎移植產(chǎn)生的后代從受體得到營(yíng)養(yǎng)發(fā)育成新個(gè)體，但其遺傳物質(zhì)則來自它的真正親代，即供體動(dòng)物和與之交配的公畜。

第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

應(yīng)用

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中的應(yīng)用胚胎移植技術(shù)主要是繁殖生物學(xué)。早期研究的重點(diǎn)在于卵母細(xì)胞的成熟、受精過程和胚胎的早期發(fā)育。后來主要研究胚胎與子宮環(huán)境的關(guān)系，特別是研究影響胚胎存活的一些因素：如胚胎——子宮同期化，妊娠建立對(duì)類固醇的需要、母體衰老、胎兒生長(zhǎng)的遺傳特性，以及轉(zhuǎn)基因和胚胎冷凍等方面。第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES)是一種從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，ICM)或原始生殖細(xì)胞(primordialgermcell，PGC)經(jīng)體外分化、抑制培養(yǎng)、分離和克隆得到的具有發(fā)育全能性的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的細(xì)胞。自從建立了小鼠胚胎干細(xì)胞系以來，科學(xué)家先后建立了魚類、鳥類、哺乳動(dòng)物以及人類的胚胎干細(xì)胞系.在培養(yǎng)細(xì)胞與個(gè)體發(fā)育之間、體細(xì)胞與生殖細(xì)胞之間架起了橋梁。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

克隆猴第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

PPL公司克隆豬第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

克隆高產(chǎn)奶牛第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一克隆鼠第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一

研究:亞系建立、誘導(dǎo)分化條件、化學(xué)誘變、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、克隆動(dòng)物、分化過程中重要標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)、干細(xì)胞map建立應(yīng)用:細(xì)胞治療與組織工程種子細(xì)胞第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一治療性克隆第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一胚胎干細(xì)胞以其多能性及無限制增殖為應(yīng)用優(yōu)勢(shì),而受其腫瘤性及倫理問題所限制成體干細(xì)胞以其安全性為應(yīng)用優(yōu)勢(shì),而受其分離純化擴(kuò)增困難所限制第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一兩者的共同困難包括:

如何誘導(dǎo)?誘導(dǎo)到什么程度?移入體內(nèi)的干細(xì)胞是原地不動(dòng)還是移行它處?干細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)如何控制?異體移植干細(xì)胞如何配型?同體的干細(xì)胞經(jīng)體外操作再移入體內(nèi)其安全性如何?

第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制

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