鹽誘導(dǎo)氧化脅迫與楊樹(shù)耐鹽性研究

鹽誘導(dǎo)氧化脅迫與楊樹(shù)耐鹽性研究（作者：王瑞剛，導(dǎo)師：陳少良教授）摘要胡楊是非常有價(jià)值的造林綠化樹(shù)種。在我國(guó)西北干旱鹽堿的荒漠和戈壁地帶，胡楊是惟一能夠形成森林的高大喬木樹(shù)種。在固定沙丘、農(nóng)田林網(wǎng)建設(shè)方面胡楊更具有不可替代的作用。胡楊具有很強(qiáng)的抗鹽性，然而其潛在的應(yīng)用價(jià)值還遠(yuǎn)沒(méi)有得到開(kāi)發(fā)利用。近年來(lái)從植物生理、生化和分子生物學(xué)等方面對(duì)胡楊的耐鹽機(jī)理進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，而關(guān)于鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫與楊樹(shù)耐鹽性的研究卻很少，而且也不深入。鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫在植物抗鹽性中的作用越來(lái)越受到重視。為此，我們以耐鹽的胡楊和不耐鹽的群眾楊、I-214楊為材料，對(duì)NaCl脅迫下根、葉和質(zhì)外體中的鹽離子、活性氧（ROS）、抗氧化酶活性及其同功酶、丙二醛（MDA）和電解質(zhì)外滲率的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，揭示了活性氧調(diào)控在胡楊耐鹽中的作用；并通過(guò)短期鹽脅迫和抑制劑處理，初步闡明了鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫信號(hào)與樹(shù)木耐鹽性的關(guān)系。主要結(jié)論如下：.在長(zhǎng)期鹽脅迫下，群眾楊葉片的CO2同化速率嚴(yán)重下降，而胡楊則維持在一個(gè)較高且穩(wěn)定的水平。Pn-Ci曲線顯示，鹽脅迫（12d）降低了兩種楊樹(shù)葉片的CO2的飽和點(diǎn)（CSP）、CO2飽和點(diǎn)的Pn（CSPn）和羧化效率（CE），卻提高了CO2的補(bǔ)償點(diǎn)（CCP）。相似的是，鹽脅迫也降低了兩種楊樹(shù)葉片的光飽和點(diǎn)（LSP）、光飽點(diǎn)的Pn（LSPn）和表觀量子產(chǎn)率（AQY），但鹽脅迫對(duì)群眾楊葉片光反應(yīng)的抑制作用顯著高于胡楊。葉綠素?zé)晒獾臄?shù)據(jù)顯示，長(zhǎng)期鹽脅迫（12d）對(duì)群眾楊葉片光適應(yīng)和暗適應(yīng)的熒光參數(shù)有顯著的影響：（1）由于鹽誘導(dǎo)的初始熒光（Fo）的升高和最大熒光（Fm）的顯著下降導(dǎo)致了PSII最大熒光量子產(chǎn)率的下降；（2）在光適應(yīng)的葉片上，鹽脅迫降低了光化學(xué)猝滅（qP），卻提高了非光化學(xué)猝滅（qN）。相反，胡楊葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)則沒(méi)有相應(yīng)的變化。說(shuō)明同樣的鹽脅迫對(duì)胡楊光合作用的抑制明顯弱于群眾楊。.光合作用受阻與鹽離子在葉片中的大量積累造成的膜傷害有關(guān)。我們的結(jié)果顯示，長(zhǎng)期鹽脅迫下，群眾楊葉片中鹽離子大量積累，特別是葉綠體中鹽離子的積累，是導(dǎo)致葉片光合作用受阻的主要原因。鹽離子的積累與電解質(zhì)外滲率和MDA含量的增加成正相關(guān)，這可能是由于鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫造成了膜質(zhì)過(guò)氧化的加劇，膜質(zhì)過(guò)氧化的加劇又導(dǎo)致膜滲透性增加的結(jié)果。耐鹽的胡楊則不同，由于葉片和葉綠體中積累了較少鹽離子，基本沒(méi)有造成膜質(zhì)過(guò)氧化，從而維持了膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膜質(zhì)過(guò)氧化的加劇與ROS的調(diào)控有關(guān)。在鹽脅迫的前期，胡楊一方面可以通過(guò)誘導(dǎo)下部葉片變黃脫落來(lái)減少鹽誘導(dǎo)的水分脅迫，從而延緩鹽離子的根冠運(yùn)輸，而葉片脫落與超氧陰離子自由基（02-.）增加促進(jìn)乙烯合成有關(guān)；另一方面胡楊能及時(shí)提高上部葉片抗氧化酶的活性（抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX），過(guò)氧化物酶（POD），過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）），有效地控制了02-.和H2O2的積累，避免了氧化傷害，保護(hù)了膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。而群眾楊則不能很快的感知鹽脅迫并作出相應(yīng)的反應(yīng)。隨著鹽脅迫的進(jìn)行，群眾楊葉片中鹽離子大量積累，光合受阻，并誘導(dǎo)了ROS（02-和H2O2）大量積累，盡管抗氧化酶的活性也明顯的升高，但都不足以有效的控制ROS的傷害，從而使葉片出現(xiàn)了傷害癥狀，隨著葉片傷害面積的增加，其超氧化物歧化酶（SOD）和POD活性顯著下降，加劇了膜質(zhì)過(guò)氧化和膜透性的增加。而胡楊則不同，盡管也有鹽離子在葉片中大量積累，但其能通過(guò)及時(shí)提高抗氧化酶的活性，有效控制鹽誘導(dǎo)的ROS的積累，從而避免氧化損傷，維持膜的穩(wěn)定性。值得注意的是，與群眾楊和I-214楊相比，胡楊在鹽脅迫初始階段就能大幅度上調(diào)SOD、POD活性，迅速阻止葉片中活性氧的積累，避免其對(duì)膜的傷害．這是典型的植物抗逆的預(yù)警機(jī)制。.通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期鹽脅迫下根組織中ROS和抗氧化酶活性變化的研究，結(jié)果顯示，胡楊根組織能迅速感知鹽脅迫，并上調(diào)抗氧化酶的活性來(lái)減少鹽誘導(dǎo)的氧化損傷，長(zhǎng)期鹽脅迫下又能保持高水平的抗氧化酶系統(tǒng)，很好的控制了ROS的水平，避免了氧化損傷，維持膜的穩(wěn)定性，從而減少了鹽離子的吸收運(yùn)輸。而群眾楊在鹽脅迫初期不能迅速上調(diào)抗氧化酶的活性，長(zhǎng)期鹽脅迫下，抗氧化酶活性又降低，造成了氧化損傷，破化了膜系統(tǒng)，更促使了鹽離子的積累。.利用壓力室的方法獲取質(zhì)外體溶液和H2O2的細(xì)胞化學(xué)染色，進(jìn)一步研究了質(zhì)外體中ROS和抗氧化酶活性的的變化。結(jié)果顯示，隨著鹽脅迫的進(jìn)行，群眾楊質(zhì)外體中鹽離子大量積累，誘導(dǎo)了ROS（O2-和H2O2）大量積累，盡管抗氧化酶的活性也明顯的升高，但仍不足以有效的控制ROS的傷害，從而使葉片出現(xiàn)了傷害癥狀。而胡楊則不同，盡管也有鹽離子在葉片中積累，但其能通過(guò)及時(shí)提高抗氧化酶的活性，控制鹽誘導(dǎo)的ROS的積累，從而有效地避免了氧化損傷，維持了膜的穩(wěn)定性。這些結(jié)果都表明抗氧化脅迫在兩種楊樹(shù)的耐鹽性中起了重要的作用。.通過(guò)低鹽短期脅迫和抑制劑實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，鹽誘導(dǎo)的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與樹(shù)木耐鹽性密切相關(guān)，耐鹽的胡楊能快速的感知鹽脅迫，提高ABA的含量，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，即緩和了鹽誘導(dǎo)的滲透脅迫，又減少了鹽離子的吸收和根冠運(yùn)輸，而在此過(guò)程中ROS起到中間環(huán)節(jié)作用，并且ROS誘導(dǎo)抗氧化防御的上調(diào)能有效的避免鹽誘導(dǎo)的氧化損傷。不耐鹽的群眾楊對(duì)鹽脅迫反應(yīng)遲鈍，不能很快適應(yīng)環(huán)境，可能是其不耐鹽的主要原因之一。總之，胡楊耐鹽性的獲得可能是由于提高了抗氧化脅迫能力。一方面，在長(zhǎng)期鹽脅迫下，胡楊不僅能通過(guò)誘導(dǎo)O2-.上調(diào)，促進(jìn)乙烯的合成，誘導(dǎo)落葉來(lái)減少蒸騰；而且能有效控制葉組織、根組織和質(zhì)外體中ROS水平，避免氧化損傷，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。另一方面，鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫信號(hào)在胡楊耐鹽性中起重要的作用，既能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，減少蒸騰，又能減少氧化損傷。關(guān)鍵詞：楊樹(shù)，耐鹽性，光合，鹽離子，活性氧，抗氧化酶，氧化脅迫信號(hào)，丙二醛，電解質(zhì)外滲率Salt-inducedoxidativestressandtherelevancetosalt

toleranceinPoplars(WangRuigangDirectedbyProf.ChenShaoliang)AbstractPopuluseuphraticaOliv.isavaluabletreespeciesusedforafforestationonsalineandalkalinedesertsits,andplaysveryimportantrolesinstabilizingsanddunes,andinagricultureshelterbeltconstructioninnorth-westChina.P.euphraticahasahighercapacitytotoleratesalinity,butit’spotentialapplicationvalueisnotdevelopedabundantly.Recently,physiological,biochemicalandmolecularmechanismsofsalttolerancehavebeeninvestigatedinP.euphratica,buttherelationshipbetweensalt-inducedoxidativestressandsalt-toleranceislessknown.Moreover,salt-inducedoxidativestresshasreceivedmuchattention.Inordertoelucidatemechanismofreactiveoxygenspecies(ROS)regulationandtherelevancetosalt-toleranceinwoodyplants,weusedsalt-tolerantP.euphraticaandsalt-sensitiveP.popularisandP.cvI-214toinvestigatetheeffectsofincreasingNaClontissuesaltconcentration,ROS,anti-oxidativeenzymes,malondialdehyde(MDA)andmembranepermeability(MP)inleaves,rootsandtheapoplast.Inaddition,wedesignedexperimentstoclarifythecorrelationbetweensalt-inducedoxidativestresssignalandsalt-toleranceinpoplars.Inalonger-termofsalinity,CO2assimilationinP.populariswasseverelyreducedwhereasstressedP.euphraticamaintainedarelativelyhigherandconstantlevelofPn.Pn-Cicurvesshowedthatsaltstress(12days)reducedCO2saturationpoint(CSP),CO2saturatedPn(CSPn),andcarboxylationefficiency(CE),butincreasedCO2compensationpoint(CCP)inthetwogenotypes.Similarly,salinityloweredlightsaturationpoint(LSP),lightsaturatedPn(LSPn),andapparentquantumyield(AQY)inbothgenotypesbuttheinhibitoryeffectofNaClonlightreactionwasmorepronouncedinP.popularis,ascomparedtoP.euphratica.Chlorophyllafluorescencedataindicatedthatalonger-termofsaltstress(12days)exhibitedamarkedinfluenceonfluorescenceparametersofP.popularisinbothdark-andlight-adaptedstates:(i)NaClinhibitedthemaximalefficiencyofPSIIphotochemistry(Fv/Fm)duetothesalt-inducedincreaseofFo(theminimalfluorescence)andthemarkeddeclineofFm(themaximalfluorescence);(ii)salinitydecreasedcoefficientofphotochemicalquenching(qP)butmarkedlyelevatedcoefficientofnonphotochemicalquenching(qN)inthelight-adaptedstate.Incontrast,therewerenocorrespondingchangesofchlorophyllafluorescenceinsalinisedP.euphratica.ThisindicatedlesseffectofsamesaltstressonphotosynthesisinP.euphraticaisthanP.popularis.Inhibitionofleafphotosynthesisisrelatedtomembranedamagecausedbysaltbuild-upinthelong-termsaltstress.Resultsshowthatsaltionaccumulationinleaves,especiallyinchloroplast,inhibitedphotosynthesisofP.popularis.TheincreaseofMPandMDAwasresultedfromasaltbuildupinleaves,whichleadstomembraneperoxideandinionleakage.Incontrast,P.euphraticamaintainedstabilityofmembranesystemundersaltstressandsalinitydidnotcausemembraneperoxidationsincelesssaltionaccumulatedinP.euphraticaleaves.ResultsshowthattheaccelerationofmembraneperoxidationwasassociatedwithROSregulation.Atthebeginningofsalinity,P.euphraticacanalleviatedNaCl-inducedwaterstressandlimitedshoot-to-roottransportofsaltionbyinducingabscissionofyellowleavesinlowershoot,Moreoverleafabscissionwasassociatedwithaincreaseofethylenesynthesisinducedbysuperoxideradical(O2-.)upregulation.P.euphraticasignificantlyincreasedanti-oxidativeenzymes(ascorbateperoxidase(APX),catalase(CAT)andglutathionereductase(GR)inleavesoflowershoottocontrollevelsofO2-.andH2O2,thusavoidingoxidativedamageandmaintainingintegralityofmembranesystem.Incontrast,P.popularisisnotabletosensesaltstressandmakecorrespondingchangesforsaltadaptation.Afterexposuretosaltstress,agreatbuildupofNa+andCl-restrainingphotosynthesisinducedasignificantincreaseofROSinleavesandxylemsapofP.popularisdespiteanotableincreaseofanti-oxidativeenzymes,whichresultedinleaf-injuryultimately.UnlikeP.popularis,P.euphraticacouldeffectivelypreventsalt-inducedROSaccumulationbyup-regulatinganti-oxidativeenzymesalthoughtherewasagreatbuildupofsaltioninleavesandxylem(especiallyNa+),whichisfavorabletoavoidoxidativedamageandmaintainmembraneintegrity.Accordingly,thatthecapacityforanti-oxidativestressplaysanimportantpartinsalttoleranceinpoplars.Weinvestigatedtheeffectofalong-termsaltstressonROSandanti-oxidativeenzymesactivitiesinroots.ResultsshowthatP.euphraticarootcouldrapidlysensetheinitialsalinityandreducesalt-inducedoxidativedamagebyup-regulatinganti-oxidativeenzymes;whileinalong-termsaltstress,P.euphraticacouldeffectivelycontrolROSlevelsbymaintaininghigherlevelanti-oxidativeenzymessystem,whichisbenefittoavoidoxidativedamageandmaintainmembranestability,thesaltionabsorptionandtransportwereconsequentlyreduced.However,P.populariswasnotabletoup-regulateanti-oxidativeenzymesaftertheonsetofsaltstress.Thesalt-induceddeclineofanti-oxidativeenzymesinP.popularis,leadstooxidativeinjuryofmembranesystem,whichcausingsaltionaccumulation.Weobtainedxylemsapbypressurechambertoinvestigatesalt-inducedchangeofROSandanti-oxidativeenzymesintheapoplast.CellularH2O2locationwasdeterminedbycytochemistrystaining.ResultsshowedthatthesaltionaccumulationintheapoplastofP.popularisinducedROS(O2-.andH2O2)buildupinalong-termsaltstress.Theincreasedanti-oxidativeenzymeswasnotabletoremoveROSinjury,leadingtosaltdamageinP.popularisleaves.AlthoughsaltionbuilduptookplaceinP.euphraticaleaves,activitiesofanti-oxidativeenzymeswereinceasedcorrespondinglytopreventsalt-inducedexcessROSaccumulationandavoidoxidativeinjury,whichcontributingtomembranestabilitymaintenance.UsingABAsynthesisinhibitor,wefoundedthatsaltinducedABAsignaltransductionwasassociatedwithsalttoleranceinP.euphratica.Salt-tolerantP.euphraticacouldsensetheinitialsaltstress,inceaseABAcontentinleavesandinducedstomataclose,whichalleviatessalt-inducedos