第四章目的基因的制備

第四章目的基因的制備第一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一目的基因：決定生物的優(yōu)良性狀、具有應(yīng)用價(jià)值或應(yīng)用前景，并被用于構(gòu)建物種新特性的基因。結(jié)構(gòu)基因：包括從5’端mRNA轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)開始到3’端mRNA轉(zhuǎn)錄終止信號結(jié)束的全部功能單位。這些功能單位包括：轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)、核糖體識別和結(jié)合區(qū)、編碼區(qū)（起始密碼，開讀框、終止密碼）、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。第二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一1)原核生物的基因組成操縱子（Operon）：功能密切相關(guān)的基因聚集在一起，處于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的調(diào)控之下，并具有相同的轉(zhuǎn)錄終止區(qū).第三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一啟動區(qū)：RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。第四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一SD序列：核糖體識別和結(jié)合的序列，通常位于起譯密碼子上游4-9bp處。序列特征為：AGGAGG,它與核糖體核糖體16SrRNA的3‘序列3’UCCUCC5’互補(bǔ)配對，從而使核糖體與mRNA結(jié)合,啟動翻譯過程。第五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一編碼區(qū)：

翻譯起始密碼（ATG）：位于SD序列后4-9bp

多肽鏈編碼區(qū)：翻譯終止密碼（TAG，TGA,TAA）：某些基因后面只有一個(gè)終止密碼，某些基因后面有兩個(gè)終止密碼.第六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)錄終止區(qū)終止子：原核生物基因在轉(zhuǎn)錄終止前的一段提供轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列（Terminator）.

特點(diǎn)：回文結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄后可形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)，從而使聚合酶減慢或停止前進(jìn).a）不依賴于終止因子的終止子（簡單終止子）含有寡聚T序列和一段富含GC的序列

b）依賴于終止因子（）的終止子.

不含寡聚T序列，回文結(jié)構(gòu)不含富GC的序列終止因子：幫助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（Terminationfactor）

第七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一

終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)第八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)真核生物基因組成

真核生物基因組的一般特點(diǎn)

a）基因位于染色體上，基因之間存在較長的非編碼區(qū)

b）一個(gè)結(jié)構(gòu)基因內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)非編碼的間隔序列第九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)：真核生物的三類RNA(rRNA,mRNA,tRNA)分別由RNA聚合酶I、II和III進(jìn)行轉(zhuǎn)錄.它們啟動子的結(jié)構(gòu)也不相同.編碼蛋白質(zhì)的啟動子由RNA聚合酶II識別.第十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一基因區(qū)：特點(diǎn)：a）無類似于原核基因中的核糖體識別區(qū)

b）含有不編碼的間隔序列轉(zhuǎn)錄終止區(qū)：含有高度保守序列AATAAA，該序列與mRNA轉(zhuǎn)錄后3’端加poly（dA）尾有關(guān)第十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3)其它基因組的特點(diǎn)病毒（噬菌體）基因組的特點(diǎn)

a）編碼的基因位于DNA或RNA上

b）以多順反子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（SV40）

c）部分基因重疊并含有內(nèi)含子線粒體基因組的特點(diǎn)

a）DNA編碼的蛋白與能量代謝有關(guān)

b）以多順反子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

c）無S.D序列

d）動物線粒體基因無內(nèi)含子，某些植物線粒體基因有內(nèi)含子葉綠體基因組的特點(diǎn)

a）DNA編碼與光合作用有關(guān)的蛋白或酶

b）以多順反子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

c）含有類似于原核基因組的啟動子和S.D序列第十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2.基因的特殊排列對于大多數(shù)基因來說，基因組中的基因一個(gè)接一個(gè)排列在DNA分子上，在基因之間存在長度不等的間隔區(qū)，但某些生物基因組中的基因存在重疊，重復(fù)，加倍和重排等現(xiàn)象第十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一1）基因重疊一個(gè)基因內(nèi)包含另一個(gè)基因的現(xiàn)象

a）部分重疊：兩個(gè)基因的序列部分重疊

b）完全重疊：一個(gè)基因完全包含在另一個(gè)基因內(nèi)第十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2）重復(fù)基因在某些生物基因組中，某些基因存在多個(gè)拷貝的現(xiàn)象*真核生物基因組中組蛋白基因第十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3）加倍基因同一細(xì)胞中至少含有兩套完全或基本相同的基因*高等生物含有兩倍以上的染色體*細(xì)菌質(zhì)粒DNA*藍(lán)藻染色體第十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4）基因重排在生物的發(fā)育過程中，同一基因簇中的基因在不同的細(xì)胞中的排列順序發(fā)生改變的現(xiàn)象.它與細(xì)胞功能的分化及表達(dá)有關(guān).*藍(lán)藻細(xì)胞中的營養(yǎng)細(xì)胞和異形胞中的nif基因存在重排現(xiàn)象第十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)目的基因的制備1.目的基因的直接分離

1)限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離：對于已知序列的DNA分子，根據(jù)DNA分子上的酶切位點(diǎn)進(jìn)行切割，然后分離所需片斷。

2)物理化學(xué)分離法：根據(jù)不同DNA或RNA分子特性的差異，采用密度梯度離心、分子雜交等方法將目的基因分離出來。第十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3)免疫法分離編碼特異性蛋白基因：核糖體沿mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)譯時(shí)產(chǎn)生多肽鏈，通過特異性抗體與核糖體－mRNA－多肽鏈復(fù)合體結(jié)合，然后分離純化抗體－核糖體－mRNA－多肽鏈復(fù)合體，獲得特定基因的mRNA。

4)酶促反轉(zhuǎn)錄分離特定基因：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成雙鏈DNA，獲得一定大小的基因片斷。第十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2.原核生物基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫（Genomiclibrary)：某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存于某一受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為該生物基因組的文庫。目的：a）分離有用的目的基因

b）保存某種生物的全部基因第二十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一1)原核生物基因組DNA的提取染色體DNA

質(zhì)粒DNA

pUC載體系統(tǒng)：制備的基因組片段>100kb*采用常規(guī)的基因組DNA的制備方法載體系統(tǒng)：制備的基因組片段>200kbp*采用常規(guī)的基因組DNA的制備方法要求：制備的DNA的長度為100-200kb，防止在制備過程中的機(jī)械斷裂第二十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)基因組DNA的不完全酶切

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶

a)四個(gè)識別位點(diǎn)限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256b)六個(gè)識別位點(diǎn)限制酶出現(xiàn)的幾率:1/1024

分離目的酶切片段大小的確定

a)克隆單個(gè)基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb

ＤＮＡ不完全酶切條件的確定

a)確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間

b)固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量第二十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一DNA的不完全酶切第二十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一克隆片段的大小與構(gòu)建文庫克隆子的關(guān)系要求：構(gòu)建的基因組文庫含目的ＤＮＡ片段（基因）的幾率（ｐ）>99%.

＊文庫理論克隆子數(shù)＝基因組ＤＮＡ總長ＤＮＡ片段平均長度＊文庫實(shí)際克隆子數(shù)＝ｌｎ（１－ｐ）ｌｎ（１－ｆ）＊ｆ＝ＤＮＡ片段平均長度基因組ＤＮＡ的總長第二十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一

基因組大?。盖衅未笮。膸炜寺∽訑?shù)的關(guān)系第二十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3)酶切片段與克隆載體連接酶切片段的分離與純化

a）低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段

b）試劑盒回收目的片段第二十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇

a）質(zhì)粒載體可承載<10kbＤＮＡ片段

b）載體可承載<20kbDNA片段

c）Cosmid載體可承載<40kbDNA片段

第二十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4)重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：DH5:用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌JM109:支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌MZ-1:溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體Ｐ啟動子質(zhì)粒載體的宿主菌第二十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

1）轉(zhuǎn)化法(transformation)2）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)3）轉(zhuǎn)染法(transfection)第二十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一5)基因組文庫克隆子的保存與篩選

a)基因文庫的保存影印膜濾保存法第三十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70oC儲存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序列過多或過少。第三十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大第三十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一b）基因文庫的篩選表型篩選法：表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選．抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長．分子雜交法：利用分子探針對文庫進(jìn)行篩選．免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交篩選．PCR篩選法：根據(jù)保守序列合成引物，擴(kuò)增特異性片段．第三十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3.真核生物基因組文庫的構(gòu)建1)真核生物基因組DNA的制備

YAC載體系統(tǒng)：制備的基因組片段>10Mbp*染色體分帶技術(shù)將各個(gè)染色體分離

載體系統(tǒng)：制備的基因組片段>200kbp*采用常規(guī)的基因組DNA的制備方法第三十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)真核基因組DNA一級文庫的構(gòu)建（YAC文庫）

a)染色體DNA的部分酶切獲得平均長度為200-500kb的DNA片段*多切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶：EcoRI，BamHI

特點(diǎn)：有較多重疊克隆子*稀切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶：NotI，MluI

特點(diǎn)：重疊克隆子較少第三十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一b)酶切片段與YAC克隆載體連接YAC克隆載體pYAC4第三十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一C)酶切片段與載體連接*第三十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一d)重組YAC載體轉(zhuǎn)化酵母球形體

1g基因組DNA500個(gè)轉(zhuǎn)化體e)YAC文庫的篩選

1）探針雜交法：以特異性的探針分子與文庫的克隆子進(jìn)行雜交

2）PCR篩選法：第三十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一f)YAC基因組文庫的保存活化菌體：將含重組載體的陽性克?。ˋB1380

菌株）劃線接種于AHC平板上，于30oC培養(yǎng)至長出1-3mm的紅色菌落。短期保存：parafilm膜將平板周圍封起來于4oC

保存4-6周。長期保存：接種一個(gè)單獨(dú)的YAC克隆子于3mlYPD培養(yǎng)基中，在30oC搖床振蕩過夜，然后加入1ml80%的甘油，混勻后分裝于-80

oC保存。第三十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3)真核基因組亞文庫的構(gòu)建（DNA載體的文庫）轉(zhuǎn)導(dǎo)E.coli第四十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4.cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫(cDNALibrary）.原理：將帶poly（A）的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接.第四十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一1)制備用于克隆cDNA的mRNAa)mRNA的制備動物細(xì)胞mRNA的制備植物細(xì)胞mRNA的制備b)mRNA的來源選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量c)mRNA完整性的檢測*mRNA在無細(xì)胞翻譯體系指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力(見下頁圖)第四十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一哺乳動物mRNA在紅細(xì)胞裂解液中翻譯SDSanalysisofproteinstranslatedbycell-freetranslationsystem.Lane1:proteinmarker;Lane2,withoutmRNA;Lane3to7:translationproductsoftotalmRNAfrommammaliancells第四十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一*mRNA在無細(xì)胞體系中指導(dǎo)合成目的多肽的能力。*mRNA分子的大小。哺乳動物mRNA長度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間。*總mRNA指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長分子的能力。第四十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一利用哺乳動物細(xì)胞提取的poly(A)+RNA合成cDNALane1:-HindIII-EcoRI;Lane2:thefirstchainofcDNA;Lane3:thesecondchainofcDNA;Lane4:

-HindIII第四十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一d)mRNA在細(xì)胞中的豐度*高豐度mRNA

目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA

量的50-90%,該類mRNA在合成和克隆cDNA之前不需進(jìn)一步純化特定mRNA.*低豐度mRNA

目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA

量的0.5%以下.第四十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)mRNA的富集典型的哺乳動物細(xì)胞含有10000-30000種不同的mRNA分子,某些mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)很低甚至只有一個(gè)拷貝．

mRNA的豐度與文庫克隆子數(shù)的關(guān)系

N=ln(1-P)ln(1-1/n)N:所需克隆數(shù);P:要求的概率;n:一種

mRNA在總mRNA中的相對比例．第四十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一a)按大小對mRNA進(jìn)行分級分離*通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子，該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.*蔗糖梯度離心：加入破壞RNA二級結(jié)構(gòu)的變性劑如氫氧化甲基汞等，再進(jìn)行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.第四十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一b)cDNA的分級分離mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的

cDNA分子分離開來.

優(yōu)點(diǎn)：*避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解．*增加了獲得全長cDNA克隆的概率．*獲得更準(zhǔn)確的分級分離效果（分子量）．第四十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一c）多聚核糖體免疫學(xué)純化法*使用抗體來純化合成目的多肽的多聚核糖體.

將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結(jié)合到免疫親和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過

Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可將目的mRNA純化數(shù)千倍.目的mRNA在細(xì)胞中的含量可為數(shù)十拷貝.第五十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3)cDNA第一鏈的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈第五十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第五十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4)cDNA第二鏈的合成a)自身引導(dǎo)合成法：單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈.*

缺點(diǎn)：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排.第五十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一自身引導(dǎo)法合成雙鏈cDNA第五十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第五十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一b)置換合成法原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口,產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈.優(yōu)點(diǎn)：a）合成cDNA的效率高．

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不純化．

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA．第五十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一置換法合成cDNA的第二鏈第五十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第五十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一c)引物-銜接頭法第五十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一第六十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一5)雙鏈cDNA分子的克隆a)同聚物加尾法利用小牛胸腺末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA和質(zhì)粒載體的3’端都加上一個(gè)互補(bǔ)的同聚片段，通過退火使兩個(gè)片段連接成重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞．第六十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一同聚物加尾法克隆雙鏈cDNA第六十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一b)接頭-銜接頭法第六十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一c)mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，將dA殘基加到mRNA：cDNA雜交體上，然后與帶dT尾的克隆載體連接，轉(zhuǎn)化受體細(xì)在宿主細(xì)胞內(nèi)，mRNA被降解并代之以DNA.缺點(diǎn)：克隆的效率低（為雙鏈cDNA克隆的1/10）第六十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一6)cDNA文庫的篩選和鑒定核酸雜交:是最常用、最可靠的方法之一.可大規(guī)模地分析文庫的克隆子*同源探針：至少含有所需cDNA克隆的一部分確切序列.常用于以一個(gè)部分克隆分離cDNA

文庫中的全長克隆.*部分同源探針：探針的序列與所要篩選的

cDNA克隆的序列相關(guān)但不相同.常用于克隆家族基因.第六十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一b)特異性免疫學(xué)檢測:在cDNA表達(dá)文庫中，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能與特異性抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，通過酶學(xué)的方法加以檢測.c)cDNA克隆的同胞檢測:將cDNA文庫分成若干組含有10-100個(gè)克隆子的易于處理的cDNA文庫，對每組cDNA文庫進(jìn)行檢測，當(dāng)鑒定出陽性庫后再不斷將其分成更細(xì)的庫進(jìn)行檢測，直到獲得陽性單克隆．第六十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一

第三節(jié)目的基因的分離1.目的基因的功能克隆1)根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列分離目的基因?qū)τ谖粗δ艿牡鞍踪|(zhì)基因，其目的基因的分離可從蛋白質(zhì)開始，通過蛋白質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)氨基酸序列的測定、相對應(yīng)的基因片斷序列的設(shè)計(jì)，制備PCR擴(kuò)增引物或合成DNA探針，從總DNA中分離目的基因片斷。或根據(jù)特異性蛋白質(zhì)制備特異性抗體，然后從表達(dá)文庫中篩選克隆子第六十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一從蛋白質(zhì)到目的基因的分離第六十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)功能互補(bǔ)克隆目的基因從某一基因組中提取總DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶不完全酶切后，與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化某一種與目的基因功能互補(bǔ)的缺陷型受體細(xì)胞。當(dāng)含有目的基因片斷的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，細(xì)胞才能生長，從而很方便地將含目的基因的克隆子挑選出來。第六十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2.序列克隆法分離目的基因1)根據(jù)部分已知序列或同源序列分離目的基因如果知道某個(gè)基因的一部分序列，或知道某基因的家族基因的序列，則可根據(jù)已知序列或家族基因高度保守的同源序列合成DNA探針，通過探針雜交技術(shù)，從DNA酶切片斷或克隆子中篩選所要克隆的目的基因片斷或克隆子。第七十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一同源探針雜交克隆目的基因第七十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)表達(dá)序列標(biāo)簽法分離目的基因

利用基因序列中一段特異性的DNA片斷（100-500bp)作為該基因與其它基因差異的標(biāo)簽（expressedsequencetag,EST)，然后以該標(biāo)簽作為獲得新基因的依據(jù)。第七十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3)基因表達(dá)系列分析法基本原理：一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA上一段9-10個(gè)堿基的核苷酸序列（sequencetag,ST,序列標(biāo)簽）代表一個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它們能被識別位點(diǎn)為四個(gè)堿基的限制性核酸內(nèi)切酶（anchoringenzyme,AE,錨定酶）所切割。多個(gè)序列標(biāo)簽通過酶切和酶連后成為雙標(biāo)簽序列的多聯(lián)體，將多聯(lián)體克隆到測序載體上。通過連續(xù)序列分析確定每個(gè)ST序列在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的拷貝數(shù)（頻率）。通過與Genebank序列比較，確定某一種ST序列是新的基因或是已克隆的基因。第七十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一基因表達(dá)系列分析法克隆分析目的基因第七十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一3.雜交法分離目的基因1)差別雜交法:

對于兩個(gè)不同生長狀態(tài)的細(xì)胞群體，目的基因在其中一個(gè)細(xì)胞群體中得到表達(dá)，而在另一個(gè)細(xì)胞群體中沒有表達(dá)，兩個(gè)細(xì)胞群體的mRNA存在明顯差異。利用可表達(dá)目的基因的mRNA構(gòu)建cDNA文庫，分別與兩個(gè)細(xì)胞群體總mRNA反轉(zhuǎn)錄后制備的cDNA探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果的差異，篩選陽性克隆子。第七十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一差別雜交法篩選含目的基因的陽性克隆子第七十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一2)

減法雜交分離目的基因減法雜交（subtractivehybridization)：又稱為扣除雜交或減數(shù)雜交。通過雜交技術(shù)除去兩種細(xì)胞群體中普遍存在的基因序列，使目的基因序列得到有效的富集。適合于目的基因拷貝數(shù)較低的基因的分離。第七十七頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一減數(shù)雜交分離目的基因第七十八頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一4.差示分析法分離目的基因mRNA差異顯示:

根據(jù)真核生物mRNA帶有poly(dA)的結(jié)構(gòu)，合成poly(dT)MN引物與mRNA的3’端互補(bǔ)，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA－mRNA雜交分子。然后合成5‘隨機(jī)引物，通過PCR擴(kuò)增獲得所有mRNA的cDNA分子。通過凝膠電泳檢測出差異的cDNA條帶。第七十九頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一差別顯示克隆目的基因第八十頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一5.功能結(jié)合法篩選目的基因

原理：在cDNA表達(dá)文庫中，目的基因表達(dá)產(chǎn)物能與其它反應(yīng)底物（探針）結(jié)合，形成一種穩(wěn)定的可明顯區(qū)別的特征，從而獲得含有目的基因的克隆子。第八十一頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一功能結(jié)合法篩選目的基因第八十二頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一6.DNA插入誘變分離目的基因

原理：將一段特定的DNA序列（標(biāo)簽DNA)插入到植物某一基因內(nèi)部或相鄰位置，誘導(dǎo)該基因突變并形成突變體，再以標(biāo)簽DNA為探針從突變體基因組DNA文庫中分離突變基因片斷，再根據(jù)突變基因片斷制備探針，從野生型植株基因組中分離野生型目的基因。第八十三頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離目的基因第八十四頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一T-DNA標(biāo)簽插入誘變分離目的基因第八十五頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一7.基因定位克隆分離目的基因

原理：根據(jù)目的基因在基因組上的位置特性對其進(jìn)行克隆。通過DNA連鎖分析、染色體缺失等方法將目的基因或其突變體定位到染色體上。在目的基因的一側(cè)或兩側(cè)確定一條或一對緊密連鎖的RFLP分子標(biāo)記。利用緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記序列作為探針，通過染色體步查等將含目的基因的克隆分離。對目的基因進(jìn)行測序及相關(guān)分析。第八十六頁，共九十四頁，編輯于2023年，星期一基因定位克隆分離目的基因的條件構(gòu)建含有大片斷DNA的基因組文庫。

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