第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

二蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

三肽鍵和肽一1當(dāng)前第1頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)肽鍵（PeptideBonds）是氨基酸連接的基本方式。1.肽鍵的結(jié)構(gòu)一、肽鍵和肽2當(dāng)前第2頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)PeptidebondSinglebondDoublebond鍵長0.145nm0.133nm0.125nm3當(dāng)前第3頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Fig.ThepeptidebondisshowninitsusualtransconfigurationofcarbonylOandamideH.4當(dāng)前第4頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)小結(jié)：肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。

肽鍵是一個平面——肽鍵平面（peptideplane）或酰胺平面（amideplane)。多數(shù)情況下，為反式構(gòu)型。5當(dāng)前第5頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)2.肽的結(jié)構(gòu)氨基末端（N末端）羧基末端（C末端）肽鍵肽鍵肽鍵

結(jié)構(gòu)通式6當(dāng)前第6頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)肽的命名(nomination)：如：Val-Ala-Lys-Gly-Arg

纈氨酰丙氨酰賴氨酰甘氨酰精氨酸絲氨酰甘氨酰酪氨酸7當(dāng)前第7頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)肽的分類（classificationofpeptide）二肽(dipeptides)：三肽：3個氨基酸通過2個肽鍵相連。四肽：少于10AA成為寡肽(oligopeptides)多于10AA成為多肽(polypeptides)分子量小于10000Da稱為多肽大于10000Da稱為蛋白質(zhì)8當(dāng)前第8頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

共價主鏈和側(cè)鏈9當(dāng)前第9頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)小結(jié)：

蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式是肽鍵（peptidebond）。有的蛋白質(zhì)分子還具有二硫鍵(disulfidebond），有鏈間二硫鍵和鏈內(nèi)二硫鍵兩種形式。肽鏈中的氨基酸由于形成肽鍵而成為不完整的分子，稱為氨基酸殘基（aminoacidresidue）。肽鏈骨干重復(fù)單位是：—N—C—C—10當(dāng)前第10頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)3.肽的物理和化學(xué)性質(zhì)—短肽為晶體，熔點(diǎn)很高—在水溶液中以兼性離子形式存在—具旋光性?物理性質(zhì)（1）酸堿性質(zhì)：主要取決于游離末端的-NH2和-COOH及R基上可解離基團(tuán)。?化學(xué)性質(zhì)11當(dāng)前第11頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（2）化學(xué)反應(yīng)?茚三酮反應(yīng)?雙縮脲反應(yīng)雙縮脲O=CO=CNH2NH2NHCu2+OH-Cu2+O=CO=CNH2NH2NHC=OC=OH2NH2NHN紫紅色絡(luò)合物12當(dāng)前第12頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)4.

天然存在的活性肽激素：胰島素

催產(chǎn)素（8肽）加壓素（8肽）抗生素：短桿菌肽S（環(huán)狀10肽）放線菌D（含2個環(huán)狀5肽）毒素：-鵝膏蕈堿腦啡肽:

13當(dāng)前第13頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

還原型谷胱甘肽14當(dāng)前第14頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)短桿菌肽和短桿菌酪肽10肽抗生素。15當(dāng)前第15頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)腦啡肽（5肽）已發(fā)現(xiàn)幾十種.如Met-腦啡肽（Tyr—Gly—Gly—Phe—Met）Leu-腦啡肽（Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu）16當(dāng)前第16頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)定義——指蛋白質(zhì)多肽鏈中aa的排列順序，包括二硫鍵的位置。17當(dāng)前第17頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)1.

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)舉例

[英]Sanger等，1953FrederickSanger胰島素（insulin）Mr:5700D含兩條肽鏈A鏈：20aaB鏈：31aa18當(dāng)前第18頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)FigTheaminoacidsequenceofthetwochainsofbovineinsulin,whicharejoinedbydisulfidecross-linkages.19當(dāng)前第19頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)2.一級結(jié)構(gòu)測定方法（DeterminingmethodsofPrimarystructureofaprotein)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。斷裂多肽鏈的二硫鍵。測定多肽鏈的氨基酸組成。分析多肽鏈的N末端和C末端殘基。將多肽鏈斷裂成肽段，并分離。測定各個肽段的氨基酸順序。確定肽段在多肽鏈中的次序。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。一般原則20當(dāng)前第20頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)(1)一般要求:a、樣品必需純（>97%以上）b、已知蛋白質(zhì)的分子量c、已知蛋白質(zhì)由幾個亞基組成21當(dāng)前第21頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

(2)測定步驟A.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定22當(dāng)前第22頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

(2)測定步驟

分析多肽鏈的N-末端和C-末端。多肽鏈N-端(amino-terminal)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定23當(dāng)前第23頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)氨基末端基氨基酸測定二硝基氟苯（DNFB）法24當(dāng)前第24頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)氨基末端基氨基酸測定丹磺酰氯法25當(dāng)前第25頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Edman法。氨基末端基氨基酸測定苯異硫氰酸（PITC）法26當(dāng)前第26頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)氨肽酶(aminopeptidases)是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。氨基末端基氨基酸測定氨肽酶法27當(dāng)前第27頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)羧基末端基氨基酸測定羧基末端---肼解法28當(dāng)前第28頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)羧肽酶(carboxypeptidase)是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解AA。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y.羧基末端基氨基酸測定羧基末端---羧肽酶法29當(dāng)前第29頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)用LiBH4使C末端氨基酸還原成氨基醇，然后水解，測定氨基酸，即可知C末端氨基酸。羧基末端基氨基酸測定羧基末端---硼氫化鋰還原法-------------H2N-CH-CO-NH-CH-COOHH2N-CH-CO-NH-CH-CH2OHLiBH4|

R1|

R2|

R1|

R230當(dāng)前第30頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（2）測定步驟B.多肽鏈的拆分。

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定31當(dāng)前第31頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

(2)測定步驟B.多肽鏈的拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定32當(dāng)前第32頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

(2)測定步驟C.二硫鍵的斷裂

還原法:-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基.SH-CH2-CH2-OH蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定33當(dāng)前第33頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

(2)測定步驟氧化法:應(yīng)用過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定34當(dāng)前第34頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（2）測定步驟D.測定每條肽鏈的氨基酸組成

根據(jù)蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定完全水解（徹底水解）不完全水解（部分水解）水解產(chǎn)物是aa混合物水解產(chǎn)物是各種大小不同的肽段和aa35當(dāng)前第35頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)水解方法反應(yīng)條件產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酸水解6MHCl或4MH2SO4共煮20hrsL-aa不引起消旋Trp被破壞；一部分羥基aa(Ser,Thr)被分解；Asn和Gln的酰胺基被水解下來堿水解5MNaOH共煮20hrsL-aa和D-aa混合物不破壞Trp引起消旋；Arg脫氨基生成鳥氨酸酶水解生理溫度、pH肽段和氨基酸混合物不破壞aa不引起消旋酶解時間長Table1-236當(dāng)前第36頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（2）測定步驟E.多肽鏈斷裂蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定多肽鏈斷裂法：酶解法和化學(xué)法37當(dāng)前第37頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解

（2）測定步驟38當(dāng)前第38頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Trypsin

：R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R239當(dāng)前第39頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr時水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶40當(dāng)前第40頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Pepsin：R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro水解受抑。肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶41當(dāng)前第41頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。肽鏈水解位點(diǎn)嗜熱菌蛋白酶42當(dāng)前第42頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(磷酸緩沖液);R1=Glu(碳酸氫銨緩沖液或醋酸緩沖液)精氨酸蛋白酶：R1=Arg肽鏈水解位點(diǎn)谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶43當(dāng)前第43頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)化學(xué)法：可獲得較大的肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法。羥胺（NH2OH）：多肽鏈的選擇性降解

（2）測定步驟44當(dāng)前第44頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（2）測定步驟F.分離肽段測定每個肽段的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定45當(dāng)前第45頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法。Edman氨基酸順序分析法苯乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸（PTH-aa）苯氨基硫甲酰氨基酸

（2）測定步驟46當(dāng)前第46頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（2）測定步驟H.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置對角線法蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定47當(dāng)前第47頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)對角線電泳（diagonaleletrophoresis）（Brown和Hartly）48當(dāng)前第48頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)49當(dāng)前第49頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點(diǎn)是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段50當(dāng)前第50頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

（2）測定步驟蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定I.肽段在多肽鏈中的次序利用重疊肽，推出肽鏈的氨基酸順序。51當(dāng)前第51頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)三、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

three-dimensionalstructure

52當(dāng)前第52頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)構(gòu)型（configuration）是指在一個不對稱性的化合物中不對稱中心上的幾個原子或基團(tuán)的空間排布方式。這種排列方式的改變會牽涉到共價鍵的形成或破壞，而與氫鍵無關(guān)，是一種兩維的變化。例如單糖的α-、β-型，氨基酸的L-、D-型都是構(gòu)型。構(gòu)象（conformation）是表示一個分子結(jié)構(gòu)中一切原子沿共價鍵（單鍵）轉(zhuǎn)動時而產(chǎn)生的不同空間排列，它通常與分子的不對稱性無關(guān)。這種排列的變化會涉及到氫鍵等次級鍵的形成和破壞，而不改變共價鍵，這是三維空間的變化，如多肽及蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)即屬于構(gòu)象。53當(dāng)前第53頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（一）多肽鏈折疊的空間限制Fig.

Limitedrotationcanoccuraroundtwoofthethreetypesofbondsinapolypeptidechain.1.肽平面（酰胺平面、肽單位、肽基）54當(dāng)前第54頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)多肽鏈的構(gòu)象可用肽基間的兩面角來描述。繞C–N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱（角），繞C–C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱（角）。多肽鏈的所有構(gòu)象都可以用、兩個構(gòu)象角來描述。這兩個角（和

）決定了相鄰兩個肽平面的相對位置。2.

C的二面角（dihedralangle）

55當(dāng)前第55頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Fig1-29.Thepeptidebondplanesarejoinedbythetetrahedralbondsofthe-carbon.Theconformationshowncorrespondsto=+180°，=+180°.56當(dāng)前第56頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)3.

可允許的角和角

拉氏構(gòu)象圖(Ramachandranplot)：根據(jù)非鍵合原子之間的最小接觸距離確定二面角（，

）的允許范圍。57當(dāng)前第57頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（二）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

（ProteinSecondarystructure)概念：蛋白質(zhì)分子中主鏈折疊產(chǎn)生的、由氫鍵維系的、有規(guī)則的構(gòu)象。二級結(jié)構(gòu)的類型：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲幾種形式。維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是氫鍵。

58當(dāng)前第58頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

1.-螺旋（-helix）Φ=-57°，Ψ=-47°；FigFourdifferentgraphicrepresentationsofthe-helix.0.54nm0.15nm結(jié)構(gòu)要點(diǎn)59當(dāng)前第59頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)影響-螺旋形成的因素⑴極大的側(cè)鏈基團(tuán)（存在空間位阻）；⑵連續(xù)存在的側(cè)鏈帶有相同電荷的氨基酸殘基（同種電荷的互斥效應(yīng)）；⑶有Pro存在時，（不能形成氫鍵），因此將中斷α螺旋。⑷有Gly，因?yàn)閭?cè)鏈過于簡單，而導(dǎo)致構(gòu)象太“柔順”。60當(dāng)前第60頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

其他類型的螺旋：?310-螺旋:?π-螺旋（4.416—螺旋）:

61當(dāng)前第61頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)2．β-折疊(β-sheet):

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈，側(cè)向聚集，相鄰肽鏈上的C=O與NH形成有規(guī)則的氫鍵，所有肽鍵都參與氫鍵形成，方向與肽鏈長軸垂直。有平行（所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向）；反平行（肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同）。62當(dāng)前第62頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)Fig“Apleatedsheet”ofpaperwithanantiparallel-sheetdrawnonit.

-折疊股63當(dāng)前第63頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)3．β-轉(zhuǎn)角(β–Turn)

多肽鏈180°回折部分所

形成的一種二級結(jié)構(gòu)，常

由４個氨基酸殘基組成，

第二個殘基常為脯氨酸。

第一個aa殘基的羰基氧與

第四個aa殘基的酰胺氫之

間形成氫鍵。64當(dāng)前第64頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)R在同一側(cè)R在相對側(cè)第5次課結(jié)束65當(dāng)前第65頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)4．無規(guī)卷曲（Randomcoil)無規(guī)卷曲：無規(guī)卷曲在球狀蛋白中含量較高，對外界理化因子敏感，與生物活性有關(guān)。66當(dāng)前第66頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)67當(dāng)前第67頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（三）蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)

Supersecondarystructure在球狀蛋白質(zhì)中，若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組和在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則、在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體，充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象層次。有三種基本形式：αα，βαβ和ββ。68當(dāng)前第68頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（四）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域(domain)結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)和超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。通常都是幾個超二級結(jié)構(gòu)單元的組合。對于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基，結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)意思相同，即這類蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域（singledomain)；較大的蛋白質(zhì)含多個結(jié)構(gòu)域(multidomain).69當(dāng)前第69頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)兩個結(jié)構(gòu)域彼此很不相同70當(dāng)前第70頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)（五）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

Tertiarystructure蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用在空間進(jìn)一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu),是球狀分子特有的結(jié)構(gòu)。指多肽鏈中所有的原子或基團(tuán)的空間排列。71當(dāng)前第71頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)S-SbondS-SbondActivesite蝦紅素(

Astacin)72當(dāng)前第72頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)維持三級結(jié)構(gòu)的作用力：主要有氫鍵、疏水相互作用、離子鍵(鹽鍵)、范德華力等。尤其是疏水相互作用。73當(dāng)前第73頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)

這些弱的相互作用（或稱非共價鍵，或次級鍵），是蛋白質(zhì)分子的主鏈和側(cè)鏈上的極性、非極性、離子基團(tuán)相互作用形成的。74當(dāng)前第74頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)圖4－6維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵CH3CH31．氫鍵（HydrogenBond）兩個重要的特征：方向性飽和性75當(dāng)前第75頁\共有86頁\編于星期五\22點(diǎn)圖4－6維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵