WB培訓(xùn)班教學(xué)講解課件

北京康為世紀(jì)生物科技有限公司BeijingCoWinBiotechCo.,Ltd.WesternBlot

WesternBlot定義WesternBlot又稱免疫印跡，是指將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的抗體來檢測(cè)目的蛋白的一種方法。

FcFabAg抗體是機(jī)體針對(duì)外界抗原產(chǎn)生的一種免疫球蛋白抗體可以特異性的識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)抗原WesternBlot基于抗原與抗體特異性結(jié)合原理

WesternBlot基本原理

研究檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析蛋白質(zhì)分子的相互作用研究

WesternBlot應(yīng)用WesternBlot主要步驟

蛋白樣品制備SDS轉(zhuǎn)膜抗體檢測(cè)

顯色或發(fā)光蛋白樣品制備1蛋白抽提的基本方法物理方法反復(fù)凍融機(jī)械攪拌超聲研磨酶解法化學(xué)方法自溶法

洗滌劑總蛋白的提取細(xì)胞總蛋白的提取材料：293T細(xì)胞（5×106個(gè)）試劑：Mam-哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑檢測(cè)beta-actin，分子量43KDa注意：為防止蛋白酶對(duì)蛋白的降解，加入PMSF，低溫操作取200ul細(xì)胞裂解液，加入2ulPMSF儲(chǔ)存液，終濃度為1mM。PMSF:絲氨酸蛋白酶抑制劑【配制方法】用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分裝成小份貯存于-20℃。如有必要可配成濃度高達(dá)17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L）?！咀⒁狻縋MSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說明雙縮脲法靈敏度低中速，20~30分鐘多肽鍵＋堿性Cu2＋生成紫色絡(luò)合物硫酸銨、Tris緩沖液、某些氨基酸用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏快速，5～10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正；不消耗樣品，測(cè)定后樣品仍能回收利用Folin－酚試劑法（Lowry法）靈敏度高慢速，40～60分鐘雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化;標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性差考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)靈敏度更高快速，5～15分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm強(qiáng)堿性緩沖液；TritonX-100;SDS較好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化;標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性BCA法靈敏度非常高較快速40分鐘內(nèi)在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+螯合劑；略高濃度的還原劑抗干擾能力強(qiáng)，蛋白不可逆的變性BCA定量在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)分子中的肽鏈結(jié)構(gòu)能與Cu2+絡(luò)合，將Cu2+還原成Cu+。BCA試劑可敏感特異地與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色復(fù)合物。在562nm處有高的光吸收值，顏色的深淺與蛋白濃度呈正比。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。實(shí)例分析

SDS2SDSSDSSDS與蛋白結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，復(fù)合物呈長(zhǎng)橢圓棒，SDS只取決于蛋白分子量大小。

SDS凝膠成分SDS：SDS-PolyAcrylamideGelElectrophoresis丙烯酰胺(A)：形成聚合物鏈N,N’-亞甲雙丙烯酰胺(B)：形成縱向架橋（cross-linkage）過硫酸銨(APS)：助凝劑TEMED(si)：催化劑

O∥CH2=CH–C–NH2

OO∥∥CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2

︱

CONH2CONH2CONH

︱︱︱–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH–

︱CONH︱CH2︱CONH

CONH2CONH2︱

︱︱–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH–

︱CONH︱

APS,TEMED(神經(jīng)毒性)ABCW0022凝膠制備試劑盒提供全套蛋白電泳試劑濃縮膠分離膠5%pH6.812%pH8.8蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠以前，先被濃縮成一條細(xì)線，使每個(gè)蛋白的起跑線相同，提高解析度。pH不連續(xù)凝膠不連續(xù)緩沖液成分不連續(xù)特點(diǎn)：不

連

續(xù)

系

統(tǒng)SDSPAGESDS分離膠濃度最佳分離范圍6%50-150kD8%30-90kD10%20-80kD12%12-60kD15%10-40kD40分鐘SDS灌膠配制10%的過硫酸銨配制12%分離膠（5ml)待膠灌至距離玻璃板頂端1.5cm的時(shí)候停止灌膠，加入蒸餾水聚合40分鐘后，倒掉蒸餾水配制5%濃縮膠（2ml）灌濃縮膠插上梳子，聚合20分鐘注意：灌膠過程中避免產(chǎn)生氣泡ABCD90V120V濃縮膠分離膠泳道1234567

8910樣品1×上樣緩沖液預(yù)染marker陽(yáng)性對(duì)照樣品樣品樣品1×上樣緩沖液1×上樣緩沖液1×上樣緩沖液1×上樣緩沖液體積(ul)10

555

10

2010

10

10

10藍(lán)色預(yù)染中分子量蛋白Marker

轉(zhuǎn)膜3印跡膜選擇轉(zhuǎn)移方法半干轉(zhuǎn)用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移方法；適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白；半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的；1.2-2MA/CM21h濕轉(zhuǎn)將膜、膠、濾紙整個(gè)浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的方法；適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白；濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定；300mA1h封閉+陽(yáng)極-陰極多孔墊片濾紙凝膠膜濾紙

墊片

2層濾紙

膜（左上角標(biāo)記）凝膠（Marker靠左）

2層濾紙墊片白色夾板（正極）黑色夾板（負(fù)極）300mA1h56mA/膜1h轉(zhuǎn)移操作轉(zhuǎn)膜后確認(rèn)麗春紅可逆染色與下游WB檢測(cè)完全相容，無任何干擾蛋白質(zhì)預(yù)染Markers實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子量參照

抗體檢測(cè)4多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對(duì)多個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生的抗體單克隆抗體：針對(duì)某一抗原決定簇，由單株淋巴細(xì)胞（克?。┧a(chǎn)生的抗體多克隆抗體單克隆抗體多抗和單抗比較單抗Id1Id1多抗多抗和單抗比較多克隆抗體單克隆抗體來源小鼠，大鼠，兔子，羊等鼠源性，兔源性特點(diǎn)來源廣泛，制備容易純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無血清交叉反應(yīng)直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色缺點(diǎn)：要求抗體濃度高，每種一抗均需用酶來標(biāo)記間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在二抗上優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，只需少數(shù)幾種動(dòng)物的二抗就可以和所有一抗相匹配封閉去除非特異結(jié)合位點(diǎn)：BlockingBuffer：3%BSA

5%MilkRoomTemperature1h.

抗體孵育一抗的選擇單克隆抗體多克隆抗體

二抗的選擇

HRP，AP，生物素，熒光素，羅丹明標(biāo)記注意：抗體的稀釋倍數(shù)是由底物和待檢測(cè)蛋白質(zhì)的豐度決定的，為了獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈推薦進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù).MMP-9抗MMP-9的兔單克隆抗體（注意說明書上的應(yīng)用種屬和實(shí)驗(yàn)）抗MMP-9的鼠單克隆抗體抗MMP-9的兔多克隆抗體HRP（辣根過氧化酶)AP（堿性磷酸酶）大小40kD140kD最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特異性好于AP抑制劑氰化物，硫化物疊氮鈉氰化物，砷酸鹽，有機(jī)磷，二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑穩(wěn)定性零度以下穩(wěn)定零度以下不穩(wěn)定底物很多部分動(dòng)力學(xué)特性快速慢價(jià)格便宜昂貴發(fā)光底物

ECL顯色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP兩種常用檢測(cè)酶系統(tǒng)的比較一抗（抗β-actin兔多抗）WB：1:1000-1:4000稀釋二抗（山羊抗兔HRP）WB：1:2000-1:10000稀釋OneStepWesternKit(Rabbit)一步法快速WB試劑盒（兔源）CW2029OneStepWesternKit(Mouse)一步法快速WB試劑盒（鼠源）CW2028節(jié)省常規(guī)WB的封閉、一抗孵育、漂洗、二抗孵育的過程GoldCassette-HISHIS重組標(biāo)簽蛋白快速檢測(cè)試劑盒CW2005GoldCassette-GSTGST重組標(biāo)簽蛋白快速檢測(cè)試劑盒CW2007

實(shí)驗(yàn)過程中不需要進(jìn)行SDS和WB，即可判斷基因是否得到表達(dá)。本產(chǎn)品尤其適用于重組蛋白表達(dá)工程菌和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的初篩(最低可檢測(cè)到的融合蛋白濃度為10ng/ml)

顯色或發(fā)光5檢測(cè)方法化學(xué)顯色法方便、便宜、有毒、靈敏度較低、費(fèi)抗體、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測(cè)化學(xué)發(fā)光法靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應(yīng)快、線性寬、無害、特異性高、可重新剝離檢測(cè)

康為世紀(jì)化學(xué)發(fā)光底物特點(diǎn)高靈敏度：比顯色法高103-106倍靈敏度選擇（普通型10-11g,增強(qiáng)型pg級(jí)別）

節(jié)約抗體:其它底物用量1/10－1/1000強(qiáng)信號(hào)，長(zhǎng)發(fā)光，8－24小時(shí)底物穩(wěn)定，常溫保存檢測(cè)快速：1-5分鐘高特異性，高信/噪比檢測(cè)方便：X光片或CCD檢測(cè)多次曝光：選擇滿意的信號(hào)強(qiáng)度CW0048CW0049特別推薦：不需反復(fù)作WB的選擇StrippingbufferCW0056無須反復(fù)電泳和轉(zhuǎn)膜，節(jié)省寶貴時(shí)間節(jié)省珍貴的樣品在不損傷蛋白的基礎(chǔ)上，剝離一抗和二抗一份樣品，一次電泳，一次轉(zhuǎn)膜，多次印跡，更多數(shù)據(jù)45KBeta-actin45K35KGAPDH高背景信號(hào)弱或者無信號(hào)非特異性條帶信號(hào)下降太快WB常見問題分析Western熒光檢測(cè)取決：抗原含量轉(zhuǎn)膜效率一抗敏感度二抗敏感度底物敏感度顯影、定影效率高背景原因解決辦法蛋白濃度過高降低抗體濃度膜的污染使用干凈鑷子；戴手套操作；換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤(rùn)；孵育時(shí)使用脫色搖床；避免膜重疊，互相覆蓋；小心操作，勿毀損膜漂洗不完全增加漂洗時(shí)間和緩沖液體積封閉液不適合比較嘗試不同封閉液封閉不完全延長(zhǎng)封閉時(shí)間（可4℃過夜）抗體濃度過高優(yōu)化降低一抗、二抗?jié)舛绕毓鈺r(shí)間過長(zhǎng)縮短曝光時(shí)間緩沖液污染使用新配制緩沖液信號(hào)弱或無信號(hào)原因解決辦法抗原量不足增加上樣量蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存過程中降解重新制備樣品轉(zhuǎn)膜不完全轉(zhuǎn)膜后確定轉(zhuǎn)膜效率、保證膠與膜充分結(jié)合、保證電極正確裝配、控制轉(zhuǎn)膜溫度（冰袋降溫）、優(yōu)化轉(zhuǎn)膜電流及時(shí)間。膜的錯(cuò)誤選擇選擇合適膜的孔徑：>22kD蛋白選用