第六章園藝植物的染色體工程35

植物染色體工程是按照一定的設(shè)計(jì)有計(jì)劃消減、添加和代換同種或異種染色體，引發(fā)產(chǎn)生各種整倍體變異和非整倍體變異，從而改良植物的遺傳基礎(chǔ)，培育符合人們需要的新種質(zhì)或新品種的方法和技術(shù)。當(dāng)前第1頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

第一節(jié)園藝植物單倍體的制備

單倍體（haploid）是指體細(xì)胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個(gè)體。制備園藝植物單倍體一般采用離體誘導(dǎo)法從具有單倍染色體數(shù)的性器官獲得植株。其中，雄配子途徑以雄性器官為外植體，經(jīng)歷雄核發(fā)育（androgenesis）獲得單倍體；而雌配子途徑以雌性器官及其相關(guān)結(jié)構(gòu)為外植體，經(jīng)雌核發(fā)育（gynogenesis）獲得單倍體植株。當(dāng)前第2頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)一、雄配子途徑采用花藥或花粉培養(yǎng)（或游離小孢子），即離體培養(yǎng)花藥和花粉（小孢子），使小孢子改變?cè)瓉?lái)的配子體發(fā)育途徑，轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株，從中鑒定出單倍體并加倍成純合二倍體。當(dāng)前第3頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

離體條件下對(duì)植物的花粉或花藥進(jìn)行培養(yǎng)（PollenCultureandAntherCulture）獲得單倍體植株的技術(shù)最早是在1964年由印度植物學(xué)家Guha和Maheshiwari在毛葉曼佗羅（Daturainnoxia)的花藥培養(yǎng)中成功獲得單倍體植株。目前已在250多種植物中由花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株。當(dāng)前第4頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的基本程序:

外植體的選擇----預(yù)處理----表面滅菌----接種----培養(yǎng)----再生植株-----單倍體鑒定----染色體加倍----獲得純合二倍體。當(dāng)前第5頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第6頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（1）材料的表面滅菌與無(wú)菌操作：對(duì)花蕾進(jìn)行表面滅菌，然后分離花藥和花粉。（2）花粉的分離與清洗：

花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來(lái)．及時(shí)將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)前第7頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

機(jī)械分離法A.分離：把花藥放在玻璃容器中，加入一定量適當(dāng)濃度的蔗糖溶液，加入適量液體培養(yǎng)基，用注射器內(nèi)筒輕輕擠壓花藥把花粉擠出來(lái)?；蛴么帕嚢杵靼鸦ㄋ帞嚵咽够ǚ凵⒊鰜?lái)。B.過(guò)篩：把上述的花藥殘?jiān)突ǚ鄣幕旌弦航?jīng)·一定孔徑的不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾?；ǚ蹫V液注入離心管。C.清洗：花粉藥壁混合液置于100-1000轉(zhuǎn)／分的速度下離心1-5分鐘，上清液再離心，最后懸浮花粉。密度為104-105/ml。當(dāng)前第8頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（3）花粉培養(yǎng)方式：

直接培養(yǎng)法：不經(jīng)預(yù)處理直接接種于培養(yǎng)基。

看護(hù)培養(yǎng)法：花藥接種于培養(yǎng)基，上面放置一塊濾紙，花粉接種于濾紙上。

微室培養(yǎng)法:蓋玻片上滴加一滴瓊脂，花粉接種在瓊脂上，反向放置于凹型載玻片上。當(dāng)前第9頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第10頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第11頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)2.雄核發(fā)育

在適宜離體培養(yǎng)的條件下，花粉（或小孢子）的發(fā)育偏離活體時(shí)的正常發(fā)育而轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育，經(jīng)胚狀體途徑或器官發(fā)生途徑形成完整植株，稱為雄核發(fā)育。當(dāng)前第12頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第13頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：小孢子第一次分裂為均等分裂（B途徑）

形成大小相似的細(xì)胞，然后由單一類細(xì)胞形成多核花粉細(xì)胞（途徑Ⅰ)。小孢子第一次分裂為不均等分裂(A途徑)：根據(jù)第二次及以后的分裂不同又分為A-V途徑（營(yíng)養(yǎng)核分裂,途徑Ⅱ）、A-G（生殖核分裂，途徑Ⅲ）、A-VG（營(yíng)養(yǎng)和生殖核均分裂，途徑Ⅳ）、C（分裂中出現(xiàn)融合加倍等現(xiàn)象）途徑等。

當(dāng)前第14頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.當(dāng)前第15頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)第一次有絲分裂為不均等分裂.A.途徑（D.自然萌發(fā)）當(dāng)前第16頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)C途徑，在第一次不均等分裂后，營(yíng)養(yǎng)核、生殖核同時(shí)核內(nèi)復(fù)制當(dāng)前第17頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)Figure-Segmentationpatternofinvitrowheatpollenobservedfromthe1stto14thdayofantherculture.Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.Thenormalbinucleatedpollenmayfollowthenormalinsitudevelopmentalpatternformingstarchandthen,degenerate(d).Thesecondmitoticdivisiontakesplaceatthe6-8thandatthe10thdayofculture.Intheandrogeneticpollen,thevegetative,generativeorbothnucleiareabletodividegivingrisetoanembryo(e,f,g).Inpollenwithidenticalnuclei,bothcellscontributetoandrogenesis(h).Pollendegenerationcanoccurinanystepofthisprocess.Atthe14thday,multicellularstructurescanbeseen(i).

當(dāng)前第18頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第19頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)花粉植株的誘導(dǎo)：（1）胚狀體途徑直接形成胚狀體。（2）愈傷組織途徑形成愈傷組織然后分化出不定芽等器官，最后發(fā)育成完整植株。當(dāng)前第20頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第21頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第23頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)3.影響花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的主要因素（1）供體植株基因型：植物屬間、種間、品種間可能存在一定的差異。（2）小孢子發(fā)育時(shí)期：醋酸洋紅染色鏡檢花粉發(fā)育時(shí)期。大多數(shù)植物以單核后期花粉適宜花藥培養(yǎng)。（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長(zhǎng)環(huán)境和生理年齡等影響。如木本植物幼齡植株比老齡誘導(dǎo)率高；始花期和盛花期比開花末期適宜；一二年生草本生長(zhǎng)健壯且處于生殖高峰期的花粉花藥誘導(dǎo)率高。當(dāng)前第24頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第25頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子當(dāng)前第26頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)對(duì)不同發(fā)育階段的花藥進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)試確定最佳小孢子發(fā)育時(shí)期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會(huì)因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時(shí)期的確定當(dāng)前第27頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（4）預(yù)處理：

花粉和花藥培養(yǎng)中材料的預(yù)處理方法有黑暗處理、光照處理、高滲處理（蔗糖、甘露醇等）、藥物處理（秋水仙素、乙稀利、EMS等）、溫度處理以及射線處理（r射線）等。溫度處理又包括低溫處理和高溫處理，接種前的處理和接種后的處理等，采用較多的方式是把取來(lái)的材料放在冰箱里3-10℃下進(jìn)行1-15天的低溫處理。也可采用接種后預(yù)處理的方法。當(dāng)前第28頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（5）培養(yǎng)基成分：

培養(yǎng)基類型MS、Miller、Nitsh、H、N6、W14等。激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑早期要求生長(zhǎng)素促進(jìn)分裂，后期細(xì)胞分裂素促進(jìn)花粉植株的形成。碳源及其他成分高濃度蔗糖等，要求較低的銨態(tài)氮、氨基酸等。（6）溫度和光照：

前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導(dǎo)階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；分化階段光照有利于分化。（7）接種方式和密度接種方向和密度影響小孢子離體形態(tài)發(fā)生。當(dāng)前第29頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)不結(jié)球白菜小孢子培養(yǎng)當(dāng)前第30頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)二、雌配子途徑

植物胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下可以發(fā)育成單倍體植株，這就是制備單倍體的雌配子體途徑，常用的方法是通過(guò)未授粉子房和未授粉胚珠培養(yǎng)?；虿捎闷渌椒ㄍㄟ^(guò)雌配子體途徑獲得單倍體。1980年成功培養(yǎng)了未授粉的非洲菊、煙草的胚珠，獲得了單倍體植株。當(dāng)前第31頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示當(dāng)前第32頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第33頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第34頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第35頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)1.未受精子房或胚珠培養(yǎng)的意義

是以未受精子房或胚珠為外植體誘導(dǎo)單倍體的方法。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來(lái)闡明單倍體產(chǎn)生的過(guò)程。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。（1）目前部分植物花粉花藥培養(yǎng)技術(shù)尚未成功建立或誘導(dǎo)頻率過(guò)低，因此可以采用未受精子房或胚珠培養(yǎng)；（2）對(duì)于雄性不育植物也可以采用該方法培養(yǎng)單倍體；（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；（4）未授粉子房或胚珠培養(yǎng)再生植株穩(wěn)定；（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。當(dāng)前第36頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)2.雌核發(fā)育

胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細(xì)胞都可以通過(guò)離體雌核發(fā)育產(chǎn)生單倍體植株，包括（1）助細(xì)胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體；（2）卵細(xì)胞、助細(xì)胞和反足細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生單倍體；（3）非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體。當(dāng)前第37頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)3.雌核發(fā)育的主要影響因素（1）基因型：培養(yǎng)難易程度受基因型影響。（2)供體植株的生理狀態(tài)：適宜生長(zhǎng)條件下的供體植株，其未授粉子房和胚珠培養(yǎng)效果較好；生理年齡小，培養(yǎng)效果好。（3）胚囊發(fā)育時(shí)期：接近成熟階段的子房和胚珠易培養(yǎng)成功。當(dāng)前第38頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（4）培養(yǎng)基成分：A.植物激素

授粉胚珠：細(xì)胞分裂素對(duì)胚發(fā)育通常有促進(jìn)作用。未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當(dāng)添加。

B.有機(jī)物：添加有機(jī)附加物可以促進(jìn)授粉胚珠的發(fā)育。

C.蔗糖濃度：3-12%，通常5%，高濃度利于孤雌生殖。當(dāng)前第39頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第40頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第41頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（5）培養(yǎng)條件：溫度以25℃為適宜，黑暗條件有利于雌核發(fā)育。（6）接種方向：花柄插入培養(yǎng)效果好。當(dāng)前第42頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)第二節(jié)園藝植物多倍體的制備

體細(xì)胞含有3個(gè)或3個(gè)以上染色體組的生物體稱為多倍體（polyploidy）。多倍體在植物形態(tài)和細(xì)胞上都表現(xiàn)明顯的巨大性、遺傳性較豐富，變異的范圍廣；對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)性強(qiáng)，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強(qiáng)，但結(jié)實(shí)力多會(huì)下降。當(dāng)前第43頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

人工誘導(dǎo)多倍體方法較多，如利用未減數(shù)配子（2n配子），采用物理方法（機(jī)械損傷、射線、溫度、高速離心）使染色體加倍；采用原生質(zhì)體融合、胚乳培養(yǎng)等也可以獲得多倍體。采用化學(xué)方法誘導(dǎo)植物染色體加倍，常用的是秋水仙素（colchicine），具有阻礙紡錘絲形成和赤道板的產(chǎn)生而導(dǎo)致染色體加倍。此外抗微管形成的除草劑如氟樂(lè)靈（trifluralin）、氨磺靈（oryzalin）、APM等也具有染色體加倍功能。當(dāng)前第44頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)A.浸泡法無(wú)菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B.生長(zhǎng)點(diǎn)處理秋水仙素水溶液直接涂抹生長(zhǎng)點(diǎn)（頂芽或腋芽）。C.培養(yǎng)基處理將植株的任何一部分作為外植體，接種于附加一定濃度的秋水仙素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)入無(wú)秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體。當(dāng)前第45頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第46頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第47頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)離體誘導(dǎo)影響因素：（1）外植體：愈傷組織、種子、芽、莖尖分生組織、葉片、原球莖等均可；以生長(zhǎng)旺盛時(shí)期為適宜。（2）加倍劑的類型：秋水仙素、氨磺靈、氟樂(lè)靈等。（3）加倍劑濃度和時(shí)間：高濃度短時(shí)間或低濃度長(zhǎng)時(shí)間處理。（4）加倍劑的加入時(shí)間：接種前浸泡處理或先獲得無(wú)菌材料再處理。（5）助劑：如二甲基亞砜（DMSO）。當(dāng)前第48頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

胚乳培養(yǎng)

胚乳在被子植物中是雙受精的產(chǎn)物，由極核和雄配子結(jié)合成的三倍體組織。而裸子植物胚乳在受精前形成，為單倍體。僅40多種植物進(jìn)行胚乳培養(yǎng)研究，20種獲得再生植株，如獼猴桃等。多存在混倍現(xiàn)象。當(dāng)前第49頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)胚乳培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題：（1）確定適宜的發(fā)育時(shí)期（生長(zhǎng)旺盛期）；（2）嚴(yán)格區(qū)分胚乳和其他組織；（3）合理使用激素；（4）注意光、溫條件（24-280C；黑暗條件）。當(dāng)前第50頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作

生物體的核內(nèi)染色體數(shù)不是染色體基數(shù)整數(shù)倍，而發(fā)生個(gè)別染色體增減的生物體稱為非整倍體（aneuploid）。非整倍體多不具有直接利用價(jià)值，但可以利用非整倍體進(jìn)行染色體添加、消減、代換和易位，將帶有異源優(yōu)良基因的染色體或片段導(dǎo)入生物體中，從而達(dá)到定向改變遺傳特性，創(chuàng)造新類型和新品種的目的。當(dāng)前第51頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)一、染色體代換系的創(chuàng)制

生物體的染色體被異源種屬染色體所代換的品系稱為代換系，一條染色體被代換稱為單體代換系，一對(duì)染色體被代換稱為二體代換系，整套被代換稱為整套染色體代換系。常規(guī)法創(chuàng)制代換系采用單體法、缺體回交法和單端體法等。生物技術(shù)方法創(chuàng)制代換系主要是組織培養(yǎng)法，其中常用的是花藥（花粉）培養(yǎng)法。對(duì)遠(yuǎn)緣雜種的花藥（或花粉）進(jìn)行培養(yǎng)，再生植株中有可能鑒定出染色體代換系。當(dāng)前第52頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)二、染色體附加系的創(chuàng)制

將同種或異種的染色體導(dǎo)入受體中，這種染色體在受體中增加的技術(shù)叫做染色體附加。具有附加染色體的品種或品系叫附加系。導(dǎo)入一條或幾條異源種屬的染色體的品種稱為異附加系；得到一條異源染色體的的受體叫做單體附加系；達(dá)到一對(duì)染