第十章細(xì)胞骨架(王喜忠鄒方東細(xì)胞生物學(xué)全套)

第一節(jié)細(xì)胞質(zhì)骨架

●微絲(microfilament,MF)●微管（microtubules）●中間纖維（intermediatefilament,IF)●細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與功能總結(jié)當(dāng)前第1頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)第二節(jié)細(xì)胞核骨架●核基質(zhì)(NuclearMatrix)●染色體骨架●核纖層(NuclearLamina)當(dāng)前第2頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)一、微絲(microfilament,MF)

又稱肌動(dòng)蛋白纖維(actinfilament),是指真核細(xì)胞中由肌動(dòng)蛋白(actin)組成、直徑為7nm的骨架纖維。●成分●裝配●微絲特異性藥物●微絲結(jié)合蛋白●微絲功能●肌肉收縮(musclecontraction)當(dāng)前第3頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)成分●肌動(dòng)蛋白(actin)是微絲的結(jié)構(gòu)成分,外觀呈啞鈴狀,這種actin又叫G-actin，將

G-actin形成的微絲又稱為F-actin。當(dāng)前第4頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)裝 配◆MF是由G-actin單體形成的多聚體，肌動(dòng)蛋白單體具有極性,

裝配時(shí)呈頭尾相接,故微絲具有極性，既正極與負(fù)極之別?！趔w外實(shí)驗(yàn)表明，MF正極與負(fù)極都能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)快的一端為正極，慢的一端為負(fù)極；去裝配時(shí)，負(fù)極比正極快。由于G-actin

在正極端裝配，負(fù)極去裝配，從而表現(xiàn)為踏車行為。◆體內(nèi)裝配時(shí)，MF呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性，主要取決于F-actin結(jié)合的ATP水解速度與游離的G-actin單體濃度之間的關(guān)系。

◆

MF動(dòng)態(tài)變化與細(xì)胞生理功能變化相適應(yīng)。在體內(nèi),有些微絲是永久性的結(jié)構(gòu),有些微絲是暫時(shí)性的結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第5頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微絲特異性藥物◆細(xì)胞松弛素(cytochalasins)：可以切斷微絲,并結(jié)合在微絲正極阻抑肌動(dòng)蛋白聚合,因而導(dǎo)致微絲解聚?！艄砉P環(huán)肽(philloidin)：與微絲側(cè)面結(jié)合,防止MF解聚。

◆影響微絲裝配動(dòng)態(tài)性的藥物對(duì)細(xì)胞都有毒害，說(shuō)明 微絲功能的發(fā)揮依賴于微絲與肌動(dòng)蛋白單體庫(kù)間的動(dòng) 態(tài)平衡。這種動(dòng)態(tài)平衡受actin單體濃度和微絲結(jié)合蛋 白的影響。當(dāng)前第6頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微絲結(jié)合蛋白

整個(gè)骨架系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能在很大程度上受到不同的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)?！鬭ctin單體結(jié)合蛋白 這些小分子蛋白與actin單體結(jié)合，阻止其添加到微絲末端，當(dāng)細(xì)胞需要單體時(shí)才釋放，主要用于actin

裝配的調(diào)節(jié)，如proflin等?！粑⒔z結(jié)合蛋白◆微絲結(jié)合蛋白將微絲組織成以下三種主要形式：

當(dāng)前第7頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

·Parallelbundle:MF同向平行排列，主要發(fā) 現(xiàn)于微絨毛與絲狀偽足?！ontractilebundle:MF反向平行排列，主要發(fā)現(xiàn)于應(yīng)力纖維和有絲分裂收縮環(huán)。

·Gel-likenetwork:細(xì)胞皮層(cellcortex)中微絲排列形式，MF相互交錯(cuò)排列。當(dāng)前第8頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微絲功能◆維持細(xì)胞形態(tài)，賦予質(zhì)膜機(jī)械強(qiáng)度◆細(xì)胞運(yùn)動(dòng)◆微絨毛(microvillus)◆應(yīng)力纖維(stressfiber)◆參與胞質(zhì)分裂◆肌肉收縮(musclecontraction)當(dāng)前第9頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

微絲遍及胞質(zhì)各處，集中分布于質(zhì)膜下，和其結(jié)合蛋白形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞形狀和賦予質(zhì)膜機(jī)械強(qiáng)度，如哺乳地位紅細(xì)胞膜骨架的作用。當(dāng)前第10頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)成纖維細(xì)胞爬行與微絲裝配和解聚相關(guān)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)當(dāng)前第11頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

是腸上皮細(xì)胞的指狀突起，用以增加腸上皮細(xì)胞表面積，以利于營(yíng)養(yǎng)的快速吸收。微絨毛(microvillus)當(dāng)前第12頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

細(xì)胞貼壁與粘著斑的形成相關(guān)，在形成粘合斑的質(zhì)膜下，微絲緊密排列成束，形成應(yīng)力纖維,具有收縮功能。當(dāng)前第13頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

收縮環(huán)由大量反向平行排列的微絲組成，其收縮機(jī)制是肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相對(duì)滑動(dòng)。當(dāng)前第14頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)肌肉收縮(musclecontraction)

肌肉可看作一種特別富含細(xì)胞骨架的效力非常高的能量轉(zhuǎn)換器，它直接將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械能?！艏∪獾募?xì)微結(jié)構(gòu)(以骨骼肌為例)◆肌小節(jié)的組成

◆肌肉收縮系統(tǒng)中的有關(guān)蛋白

◆肌肉收縮的滑動(dòng)模型

◆由神經(jīng)沖動(dòng)誘發(fā)的肌肉收縮基本過(guò)程當(dāng)前第15頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)肌肉收縮系統(tǒng)中的有關(guān)蛋白 ①肌球蛋白(myosin)—所有actin-dependentmotorproteins都屬于 該家族，其頭部具ATP酶活力,沿微絲從負(fù)極到正極進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。

·MyosinⅡ

主要分布于肌細(xì)胞，有兩個(gè)球形頭部結(jié)構(gòu)域(具有ATPase活性)和尾部鏈,多個(gè)Myosin尾部相互纏繞，形成myosinfilament,即粗肌絲。②原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)由兩條平行的多肽鏈形成α-螺旋構(gòu)型,位于肌動(dòng)蛋白螺旋溝內(nèi),結(jié)合于細(xì)絲,調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白頭部的結(jié)合。

③肌鈣蛋白

(Troponin,Tn)為復(fù)合物，包括一個(gè)Ca2+敏感性蛋白(troponin- C,TnC),能特異與Ca2+結(jié)合。當(dāng)前第16頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)由神經(jīng)沖動(dòng)誘發(fā)的肌肉收縮基本過(guò)程 ·動(dòng)作電位的產(chǎn)生

·Ca2+的釋放

·原肌球蛋白位移

·肌動(dòng)蛋白絲與肌球蛋白絲的相對(duì)滑動(dòng)

·Ca2+的回收當(dāng)前第17頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)二．微管（Microtubules）●微管結(jié)構(gòu)與組成●裝配●微管特異性藥物●微管組織中心(MTOC)

●微管結(jié)合蛋白(MAP)●微管功能當(dāng)前第18頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微管結(jié)構(gòu)與組成

微管可裝配成單管,二聯(lián)管(纖毛和鞭毛中),三聯(lián)管(中心粒和基體中)。當(dāng)前第19頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)裝 配◆裝配方式◆所有的微管都有確定的極性◆微管裝配是一個(gè)動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定過(guò)程當(dāng)前第20頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn) α-微管蛋白和β-微管蛋白形成αβ二聚體,αβ二聚體先形成環(huán)狀核心(ring),經(jīng)過(guò)側(cè)面增加二聚體而擴(kuò)展為螺旋帶,αβ二聚體平行于長(zhǎng)軸重復(fù)排列形成原纖維(protofilament)。當(dāng)螺旋帶加寬至13根原纖維時(shí),即合攏形成一段微管。當(dāng)前第21頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)·微管裝配的動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性是指微管裝配生長(zhǎng)與快速去裝配的一個(gè)交替變換的現(xiàn)象

·動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性產(chǎn)生的原因：微管兩端具GTP帽(取決于微管蛋白濃度),微管將繼續(xù)組裝,反之,無(wú)GDP帽則解聚。當(dāng)前第22頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微管特異性藥物◆秋水仙素(colchicine)阻斷微管蛋白組裝成微管，可破壞紡錘體結(jié)構(gòu)?！糇仙挤?taxol)能促進(jìn)微管的裝配,

并使已形成的微管穩(wěn)定?！魹樾惺拐５奈⒐芄δ?微管動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性是其功能正常發(fā)揮的基礎(chǔ)。當(dāng)前第23頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微管組織中心(MTOC)◆概念：◆常見微管組織中心◆中心體(centrosome)◆基體(basalbody)當(dāng)前第24頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

微管在生理狀態(tài)或?qū)嶒?yàn)處理解聚后重新裝配的發(fā)生處稱為微管組織中心(microtubuleorganizingcenter,MTOC)。當(dāng)前第25頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)常見微管組織中心◆間期細(xì)胞MTOC：

中心體(動(dòng)態(tài)微管)

◆分裂細(xì)胞MTOC：有絲分裂紡錘體極(動(dòng)態(tài)微管)

◆鞭毛纖毛細(xì)胞MTOC：基體(永久性結(jié)構(gòu))

當(dāng)前第26頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)中心體(centrosome) ·中心體(centrosome)結(jié)構(gòu)

·中心體復(fù)制周期

·γ管蛋白：位于中心體周圍的基質(zhì)中，環(huán)形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，為αβ微管蛋白二聚體提供起始裝配位點(diǎn)，所以又叫成核位點(diǎn)

當(dāng)前第27頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)基體(basalbody)·位于鞭毛和纖毛根部的類似結(jié)構(gòu)稱為基體（basalbody）·中心粒和基體均具有自我復(fù)制性質(zhì)當(dāng)前第28頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微管結(jié)合蛋白

(MicrotubuleAssociatedProtein,MAP)當(dāng)前第29頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)微管功能◆維持細(xì)胞形態(tài)◆細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸◆細(xì)胞器的定位◆鞭毛(flagella)運(yùn)動(dòng)和纖毛(cilia)運(yùn)動(dòng)◆紡錘體與染色體運(yùn)動(dòng)當(dāng)前第30頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)維持細(xì)胞形態(tài)

用秋水仙素處理細(xì)胞破壞微管,導(dǎo)致細(xì)胞變圓,說(shuō)明微管對(duì)維持細(xì)胞的不對(duì)稱形狀是重要的。對(duì)于細(xì)胞突起部分,如纖毛、鞭毛、軸突的形成和維持,微管亦起關(guān)鍵作用。當(dāng)前第31頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸

真核細(xì)胞內(nèi)部是高度區(qū)域化的體系,細(xì)胞中合成的物質(zhì)、一些細(xì)胞器等必須經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程。這種運(yùn)輸過(guò)程與細(xì)胞骨架體系中的微管及其Motorprotein有關(guān)。

·Motorproteins ·神經(jīng)元軸突運(yùn)輸?shù)念愋图斑\(yùn)輸模式

·色素顆粒的運(yùn)輸當(dāng)前第32頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)Motorproteins

目前已鑒定的Motorproteins多達(dá)數(shù)十種。根據(jù)其結(jié)合的骨架纖維以及運(yùn)動(dòng)方向和攜帶的轉(zhuǎn)運(yùn)物不同而分為不同類型。胞質(zhì)中微管motorprotein分為兩大類：驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin):通常朝微管的正極方向運(yùn)動(dòng)動(dòng)力蛋白(cytoplasmicdynein)：朝微管的負(fù)極運(yùn)動(dòng)

Kinesin與Dynein的分子結(jié)構(gòu)

Kinesin與Dynein的運(yùn)輸方式當(dāng)前第33頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)神經(jīng)元軸突運(yùn)輸?shù)念愋洼S突運(yùn)輸?shù)念愋彤?dāng)前第34頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)鞭毛(flagella)運(yùn)動(dòng)和纖毛(cilia)運(yùn)動(dòng)·纖毛和鞭毛的運(yùn)動(dòng)形式

·纖毛與鞭毛的結(jié)構(gòu)

·纖毛運(yùn)動(dòng)機(jī)制當(dāng)前第35頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)三、中間纖維（intermediatefilament,IF)

１0nm纖維,因其直徑介于肌粗絲和細(xì)絲之間,故被命名為中間纖維。IF幾乎分布于所有動(dòng)物細(xì)胞，往往形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，特別是在需要承受機(jī)械壓力的細(xì)胞中含量相當(dāng)豐富。如上皮細(xì)胞中。除了胞質(zhì)中，在內(nèi)核膜下的核纖層也屬于IF?！裰虚g纖維的裝配●中間纖維的成分與分布●中間纖維的功能當(dāng)前第36頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)中間纖維的裝配◆中間纖維裝配過(guò)程

◆IF裝配與MF,MT裝配相比，有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

·IF裝配的單體是纖維狀蛋白(MF,MT的單體呈球形)；

·反向平行的四聚體導(dǎo)致IF不具有極性；

·IF在體外裝配時(shí)不需要核苷酸或結(jié)合蛋白的輔助，在體內(nèi)裝配后，細(xì)胞中幾乎不存在IF單體(但I(xiàn)F的存在 形式也可以受到細(xì)胞調(diào)節(jié)，如核纖層的裝配與解聚)。當(dāng)前第37頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)中間纖維的成分與分布

IF成分比MF,MT復(fù)雜，具有組織特異性。

IF在形態(tài)上相似，而化學(xué)組成有明顯的差別?！糁虚g纖維類型與分布◆中間纖維蛋白的表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性當(dāng)前第38頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)中間纖維分類與分布當(dāng)前第39頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)中間纖維的功能◆增強(qiáng)細(xì)胞抗機(jī)械壓力的能力

◆角蛋白纖維參與橋粒的形成和維持

◆結(jié)蛋白纖維是肌肉Z盤的重要結(jié)構(gòu)組分，對(duì)于維持肌肉細(xì)胞的收縮裝置起重要作用◆神經(jīng)元纖維在神經(jīng)細(xì)胞軸突運(yùn)輸中起作用◆參與傳遞細(xì)胞內(nèi)機(jī)械的或分子的信息◆中間纖維與mRNA的運(yùn)輸有關(guān)當(dāng)前第40頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)第二節(jié)細(xì)胞核骨架

●核基質(zhì)(NuclearMatrix)●染色體骨架●核纖層(NuclearLamina)當(dāng)前第41頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)核基質(zhì)(NuclearMatrix)●形態(tài)結(jié)構(gòu)●成分●核骨架結(jié)合序列●功能當(dāng)前第42頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)形態(tài)結(jié)構(gòu)◆研究核骨架的分級(jí)抽提方法 非離子去垢劑溶解膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng),胞質(zhì)中可溶性成分隨之流失;再用Tween40和脫氧膽酸鈉處理,胞質(zhì)中的微管、微絲與一些蛋白結(jié)構(gòu)被溶去,胞質(zhì)中只有中間纖維網(wǎng)能完好存留;然后用核酸酶與0.25mol/L硫酸銨處理,染色質(zhì)中DNA、RNA和組蛋白被抽提,最終核內(nèi)呈現(xiàn)一個(gè)精細(xì)發(fā)達(dá)的核骨架網(wǎng)絡(luò),結(jié)合非樹脂包埋-去包埋劑電鏡制樣方法,可清晰地顯示核骨架-核纖層-中間纖維結(jié)構(gòu)體系。當(dāng)前第43頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)成 分

核骨架不象胞質(zhì)骨架那樣由非常專一的蛋白成分組成,核骨架的成分比較復(fù)雜,主要成分是核骨架蛋白及核骨架結(jié)合蛋白,并含有少量RNA。◆核骨架蛋白◆骨架結(jié)合蛋白◆其它當(dāng)前第44頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)核骨架結(jié)合序列◆DNA序列中的核骨架結(jié)合序列(matrixassociatedregion,MAR)

這部分DNA與核骨架蛋白的結(jié)合不為高鹽溶液抽提所破壞,在基因表達(dá)調(diào)控中有作用◆核骨架結(jié)合序列的基本特征

◆MAR的功能

·通過(guò)與核骨架蛋白的結(jié)合，將DNA放射環(huán)錨定在核骨架上；

·作為許多功能性基因調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)前第45頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)核骨架結(jié)合序列的基本特征·富含AT·富含DNA解旋元件(DNAunwindingelements)·富含反向重復(fù)序列(InvertedRepeats) ·含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)前第46頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)功 能

◆核骨架與DNA復(fù)制

◆核骨架與基因表達(dá)

大量研究工作表明真核細(xì)胞中RNA的轉(zhuǎn)錄和加工均與核骨架有關(guān)。具有轉(zhuǎn)錄活性的基因是結(jié)合在核骨架上的;RNA聚合酶在核骨架上具有結(jié)合位點(diǎn)。

◆核骨架與病毒復(fù)制◆核骨架與染色體構(gòu)建當(dāng)前第47頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)二、染色體骨架●染色體骨架/放射環(huán)模型●染色體骨架的真實(shí)性◆銀染法能選擇性地顯示染色體軸結(jié)構(gòu)◆DNA酶和RNA酶處理或用0.4mol/LH2SO4處理去除組蛋白,對(duì)染色體軸沒有影響,用胰蛋白酶消化則染色體軸破壞,說(shuō)明染色體軸是非組蛋白性的?！羧旧w骨架/放射環(huán)模型在分子水平上得到兩個(gè)直接證據(jù)●染色體骨架與染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)當(dāng)前第48頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)三、核纖層(NuclearLamina)●核纖層分布與形態(tài)結(jié)構(gòu)

●成分——核纖層蛋白(Lamin)●核纖層蛋白的分子結(jié)構(gòu)及其與中間纖維蛋白的關(guān)系

●核纖層蛋白在細(xì)胞分化中的表達(dá)

●核纖層在細(xì)胞周期中的變化

●功能

當(dāng)前第49頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)成分——核纖層蛋白(Lamin)

◆哺乳動(dòng)物和鳥類細(xì)胞中有 核纖層蛋白A

核纖層蛋白B

核纖層蛋白C當(dāng)前第50頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)核纖層蛋白的分子結(jié)構(gòu)及

其與中間纖維蛋白的關(guān)系◆核纖層與中間纖維之間的共同點(diǎn)

·兩者均形成10nm纖維;·兩者均能抵抗高鹽和非離子去垢劑的抽提;·某些抗中間纖維蛋白的抗體能與核纖層發(fā)生交叉反應(yīng)·核纖層蛋白A和核纖層蛋白C的cDNA克隆推導(dǎo)出核纖層蛋白的氨基酸順序與中間纖維蛋白高度保守的α-螺旋區(qū)有很強(qiáng)的同源性,說(shuō)明核纖層蛋白是中間纖維蛋白.當(dāng)前第51頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)核纖層在細(xì)胞周期中的變化◆A型核纖層蛋白在組裝核纖層時(shí)通過(guò)蛋白水解失去C端(異戊二烯化,isoprenylation)。核膜崩解,核纖層解聚時(shí),A型核纖層蛋白以可溶性單體形式彌散到胞質(zhì)中?！鬊型核纖層蛋白則永久法尼基化(farnesylated)，與核膜小泡保持結(jié)合狀態(tài),當(dāng)核膜重現(xiàn)時(shí),在染色體周圍重裝配,形成子細(xì)胞的核纖層。當(dāng)前第52頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)功 能 ◆核膜及染色質(zhì)提供了結(jié)構(gòu)支架當(dāng)前第53頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第54頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第55頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第56頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第57頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第58頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第59頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第60頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第61頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第62頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第63頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)當(dāng)前第64頁(yè)