細胞培養(yǎng)相關(guān)問題概述

細胞培養(yǎng)相關(guān)問題概述第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一1細胞體外培養(yǎng)指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞，也可以是細胞群。第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2細胞體外培養(yǎng)的條件營養(yǎng)成分滲透壓溫度PH氣相無菌無毒的細胞培養(yǎng)環(huán)境第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2.1細胞體外生存的營養(yǎng)條件（1）水溶劑、熱穩(wěn)定性、導(dǎo)熱、表面張力；培養(yǎng)用水電阻率≥1×106Ω。（2）氨基酸20種氨基酸——必須氨基酸、非必須氨基酸；培養(yǎng)基中都含有必須氨基酸；谷氨酰胺——缺乏會引起細胞生長不良甚至死亡；——溶液中不穩(wěn)定，容易分解。如細胞生長不良，需在培養(yǎng)液中補加谷氨酰胺，終濃度在1~4mmol/L。第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（3）碳水化合物

葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉等。

葡萄糖——主要的能源物質(zhì)，細胞對葡萄糖的吸收能力最高。

丙酮酸鈉——葡萄糖消耗殆盡時，可替代葡萄糖提供能量。2.1細胞體外生存的營養(yǎng)條件第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（4）無機鹽類細胞生長所必需；維持滲透壓平衡；維持酸堿平衡——磷酸鹽、碳酸鹽等；Ca2+——組織內(nèi)部細胞之間相互粘連起重要作用；Mg2+——細胞間質(zhì)重要成分，利于細胞間相互穩(wěn)定。2.1細胞體外生存的營養(yǎng)條件第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（5）維生素

脂溶性維生素：A、D、E、K；

水溶性維生素：C、B1、B2、B6、B12、生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素等；參與構(gòu)成各種酶的活性基團成分，參與細胞生存和代謝。（6）促生長因子及激素對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)具有十分重要的作用。如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸；氫化可的松可促進表皮細胞的生長；泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。2.1細胞體外生存的營養(yǎng)條件第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2.2滲透壓細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性；不同動物細胞最適滲透壓不同；人體細胞最適：290mOsm/Kg；鼠細胞最適：320mOsm/Kg；大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜。第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2.3溫度最適溫度：35℃～37℃；≤39℃細胞代謝強度與溫度成正比；39～40℃中1h，即會受到損傷，但仍能恢復(fù)；41～42℃中1h，細胞會受到嚴重損傷，但不至于全部死亡，部分仍可能恢復(fù)；≥43℃時，細胞大多死亡。第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2.3

溫度高于0℃時，低溫只能抑制細胞代謝，并無傷害；25～35℃時，可緩慢生長；4℃放置數(shù)小時，在置于37℃，細胞仍能繼續(xù)良好生長；冰點以下，溶質(zhì)損傷、冰晶損傷，細胞死亡。第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2.4

PH每種細胞都有其最適的PH值；大多數(shù)細胞適宜7.2～7.4，偏離這一范圍對細胞不利；細胞耐酸性比耐堿性強一些；在偏酸性環(huán)境中更有利于細胞生長；有些細胞也喜歡偏堿性環(huán)境，如成纖維細胞最適合PH7.4～7.6。第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2.5氣相5%CO2+95%空氣；CO2既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分；CO2維持培養(yǎng)基的pH。HCO3-+H+?H2CO3?CO2↑+H2O第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一3細胞培養(yǎng)基的概念細胞培養(yǎng)基是人工模擬細胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。英文：Medium粉劑——傾向成為“培養(yǎng)基”液體——多稱為“培養(yǎng)液”第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4培養(yǎng)基分類天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1

天然培養(yǎng)基早期的細胞培養(yǎng)基;直接源于動物組織提取液或體液，如血清、血漿凝塊、淋巴液、胚胎浸出液等;營養(yǎng)價值高;成分復(fù)雜、差異大、不穩(wěn)定、來源受限制;血清使用最廣泛。第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1.1血清的主要成分血液=55%血漿+45%血細胞；血清——去除纖維蛋白（凝血因子）的血漿;成分復(fù)雜，大部分已知，少數(shù)未知;血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4..1.2血清的主要作用提供營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等；提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可終止胰酶的消化；血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷；血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如硒等。第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1.3血清的種類牛血清——使用最多人血清馬血清豬血清羊血清雞血清兔血清第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1.4牛血清按照采血時間的早晚來分類的；采血時間越早，營養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少；由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區(qū)進口牛血清，因此市面上的牛血清大多來自澳洲、南美洲，或是國產(chǎn)的。第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1.5牛血清的分類胎牛血清(FBS):fetalbovineserum

直接胚胎心臟取血，胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。新生牛血清(NBS):newborncalfserumornewbovineserum

嚴格：出生24h內(nèi)寬泛：出生14d內(nèi)小牛血清（CS)：calfserum

嚴格：出生10d～30d寬泛：出生1y內(nèi)第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一批次間差異較大、成分復(fù)雜不利于疫苗和單克隆抗體的生產(chǎn)保存期短（一年）、易污染含細胞毒性成分，抑制細胞生長，如多胺氧化酶、補體、抗體、細菌毒素等價格昂貴、難以保障供應(yīng)取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，導(dǎo)致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不可靠多數(shù)細胞不與血清直接接觸，血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞），同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）4.1.5牛血清存在的問題第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1.6血清的質(zhì)量鑒定外觀：土黃色或棕黃色、透明清亮、無沉淀或極少沉淀、比較粘稠；理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等；

血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高；

血紅蛋白也是越低越好。微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等；促生長效果：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。正常溶血第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.1.7血清的貯存與使用（1）貯存

長期——冷凍（≤-15℃）密封、避光；短期——4℃、密封、避光，1m以內(nèi)。第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（2）解凍2℃~8℃解凍過夜；

室溫下全溶；血清解凍的過程中不時搖勻（勿劇烈）；盡量避免反復(fù)凍融和室溫長時間放置；

用量不多時需分裝凍存使用。第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（3）血清的滅活補體(complement)：是存在于正常人和動物血清與組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。不耐熱，可輔助和補充特異性抗體，介導(dǎo)免疫溶菌、溶血作用，故稱為補體。由30余種可溶性蛋白、膜結(jié)合性蛋白和補體受體組成的多分子系統(tǒng)（補體系統(tǒng)）細胞毒作用,平滑肌細胞收縮,肥大細胞和血小板釋放組胺,增強吞噬作用,促進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。

第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一56℃滅活30min，規(guī)則搖晃除非必須，一般不需要滅活滅活會造成血清沉淀物顯著增多，血清的質(zhì)量下降（3）血清的滅活第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（4）血清使用濃度一般為5%～20%，常用10%，過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（5）血清中的沉淀絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理。經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長。第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.2合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基組分穩(wěn)定需添加血清配合使用由于細胞種類和培養(yǎng)條件不同，適宜的培養(yǎng)基也不同，主要包括：BME、MEM、DMEM、RPMI1640、HAMF12等。第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.2.1BME(BasalMediumEagle)基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基（BasalMediumEagle），1955年由Eagle設(shè)計，是最簡單的培養(yǎng)基，，BSS＋12種氨基酸＋谷氨酰胺＋8種維生素，最先用于培養(yǎng)小鼠的L細胞和人類HeLa細胞。此基礎(chǔ)上改良的細胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM等。第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一是BME的升級版僅含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素氨基酸濃度是BME的兩倍廣泛適應(yīng)各種已建成細胞系和不同地方的哺乳動物細胞類型的培養(yǎng)4.2.2EMEMorMEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium)第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一是Dulbecco改進的MEM氨基酸和維生素的濃度是BME的4倍最先葡萄糖的濃度是1g/L，稱為低糖DMEM后來增加到4.5g/L，稱為高糖DMEM主要用于雜交瘤中骨髓瘤細胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)高糖更適合高密度細胞培養(yǎng)，適用于附著稍差的腫瘤細胞、克隆培養(yǎng).4.2.3DMEM(Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium)第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一McCoy等人在1959年研制是一種專門為培養(yǎng)肉瘤細胞研制的培養(yǎng)基適用于原代細胞、組織活檢細胞和淋巴細胞培養(yǎng)，還適用于較難培養(yǎng)的細胞，如皮膚，牙齦，睪丸，小鼠腎臟，大網(wǎng)膜，腎上腺，肺，脾，大鼠胚胎和其他組織的原代生長，以及活體組織的體外移植。4.2.4McCoy5A第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一是McCoy’s5A的改進版含有高濃度的肌醇廣泛用于懸浮細胞的培養(yǎng)，如人類白細胞，骨髓瘤細胞，雜交瘤細胞等血液來源的細胞。4.2.5RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute#1640)第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一是DMEM和F12按1:1比例配制而成；神經(jīng)生物學(xué)最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；可作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液；適用于血清含量較低條件下哺乳動物細胞培養(yǎng)。4.2.6DMEM/F12第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一是由Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基較DMEM增加了幾種非必需氨基酸、硒和一些維生素最初用于培養(yǎng)紅細胞和巨噬細胞前體IMDM為營養(yǎng)非常豐富的培養(yǎng)液非常適合于迅速增殖，高密度細胞的培養(yǎng)，包括Jurkat細胞，COS-7，和巨噬細胞IMDM支持小鼠B淋巴細胞，來自骨髓的造血組織，脂多糖刺激的B細胞，T淋巴細胞，和各種雜交細胞的生長也可作為無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.2.7IMDM第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一1950年由Morgan成功研制；配方復(fù)雜，含有核苷酸，核酸等成分；最初用于雞胚肌細胞的培養(yǎng)；還用于各種細胞的維持和病毒生產(chǎn)。4.2.8M199(Medium199)第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸它可廣泛應(yīng)用于各種細胞類型包括對營養(yǎng)成分要求苛刻的細胞。4.2.9MEM-Alpha第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.2.10Ham’sF10(Ham’sNutrientMixtureF10)由Ham發(fā)明，用于人類2倍體細胞和倉鼠細胞的培養(yǎng)。4.2.11Ham’sF12(Ham’sNutrientMixtureF12):F10的升級版，含有更多的維生素、肌醇和氨基酸是為在低血清濃度下克隆CHO細胞而設(shè)計的可以在加入很少血清的情況下應(yīng)用特別適合單細胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)是無血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液用于培養(yǎng)大鼠，兔子和雞胚細胞，還用于中國倉鼠卵巢細胞以及肺細胞的培養(yǎng)第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。適用于快速增殖瘤細胞的培養(yǎng)用于在CO2缺乏的情況下培養(yǎng)腫瘤細胞株4.2.12L-15（LeibovitzMedium）第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.2.13其他培養(yǎng)基

Fischer’s細胞培養(yǎng)基：用于白血病微粒細胞培養(yǎng)William’sMediumE：用于大鼠肝上皮細胞的長期細胞培養(yǎng)。MCDB131培養(yǎng)液：用于培養(yǎng)內(nèi)皮細胞。Opti-MEMIReducedSerumMedia：用于培養(yǎng)造血細胞。植物血凝素（PHA）：增加細胞轉(zhuǎn)化和DNA合成。第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一

4.2.13培養(yǎng)基的保存與運輸干粉：24個月，2～8℃避光保存，室溫運輸。液體：12個月，2～8℃避光保存，不能冷凍，室溫運輸。第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一無血清培養(yǎng)基是加入成分明確的血清替代成分，既能滿足細胞的培養(yǎng)要求,又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。細胞功能的精確評估容易進行純化和下游加工性能一致成分明確調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化具有選擇性4.3無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.3.1無血清培養(yǎng)基發(fā)展歷程基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清無動物源性物質(zhì)化學(xué)組分限定培養(yǎng)基化學(xué)組分限定培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基無動物源性物質(zhì)培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的發(fā)展大致經(jīng)歷了4代，即第一代一般意義上的無血清培養(yǎng)基，第二代無血清無動物衍生蛋白培養(yǎng)基，第三代雙無培養(yǎng)基，以及正在研發(fā)中的第四代無血清培養(yǎng)基。第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一成分：各種可替代血清功能的生物材料，含大量成分不明的

動植物蛋白。優(yōu)點：相對于含血清培養(yǎng)基，實驗準確性、可重復(fù)性、穩(wěn)定

性較高。缺點：添加物化學(xué)成分不明確，不利于目標蛋白的分離純化。應(yīng)用：人們根據(jù)自己需要對其成分進行一些改進，應(yīng)用仍較

為廣泛。第一代：一般意義上的無血清培養(yǎng)基第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一第二代：無血清無動物衍生蛋白培養(yǎng)基

成分：完全不用動物來源蛋白，蛋白來源于重組蛋白或蛋白

水解物。優(yōu)點：降低了成本，太高了效率，加快了報批速度。缺點：成分不是十分明確，實驗及生產(chǎn)的穩(wěn)定性不是很高。應(yīng)用：主要用于生物藥品的研發(fā)和生產(chǎn)。第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一第三代：化學(xué)組分限定培養(yǎng)基——雙無培養(yǎng)基

成分：完全不含血清、無蛋白或含量極低，所含蛋白是成分

已明。優(yōu)點：可以保持細胞培養(yǎng)與生產(chǎn)的恒定，目標蛋白分離純化

更容易，成本大大降低，生產(chǎn)管理易控。缺點：但對細胞特異性高，僅用于一種或幾種細胞的培養(yǎng)。應(yīng)用：用于生命科學(xué)研究和基因工程藥物開發(fā)第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一第四代：研發(fā)階段成分：無血清、無蛋白、成分十分明確。優(yōu)點：可高溫消毒、適合不同細胞生長的全能培養(yǎng)基。應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)研究，以及工業(yè)上產(chǎn)。第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.3.2無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品的生產(chǎn)。干細胞的體外培養(yǎng)和研究。腫瘤的研究。從多中細胞混雜的培養(yǎng)中選擇目的細胞。細胞體外分化的研究。激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究。其他第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.3.3無血清培養(yǎng)基的組成及其主要補充因子1、無血清培養(yǎng)基主要由兩部分組成：A、基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM、MEM、RPIM160、DMEM/F12等。

無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般為所需培養(yǎng)細胞相應(yīng)的合成培養(yǎng)基，按需要可進行調(diào)整。B、血清替代因子：在所有的補充因子中，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒幾乎是所有細胞株在無血清培養(yǎng)基中生長都需要的。第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一2、主要補充因子（1）激素和生長因子：多肽類和甾體類激素。多肽類激素：胰島素、生長因子、胰高血糖素等甾體類激素：孕酮、氫化可的松、雌二醇等。多肽類生長因子：表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經(jīng)生長因子等。（2）結(jié)合蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白。（3）貼壁和鋪展因子：纖黏蛋白、層粘蛋白、膠原、多聚賴氨酸、昆布氨酸、血清鋪展因子等。（4）微量元素：主要是硒。第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一（5）低相對分子量營養(yǎng)元素:維生素、脂類等。

維生素B、C、E等；丁二胺、亞油酸、α-生育酚等。（6）酶抑制劑：大豆胰酶抑制劑（常用）、牛胰蛋白酶抑制劑等。第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一4.4高級培養(yǎng)基（Advancedmedium）濃縮了營養(yǎng)物質(zhì)和其他成分的培養(yǎng)基只需要<2%的血清(減少50-90%)4.5專用培養(yǎng)基一般為無血清培養(yǎng)基如角質(zhì)細胞、淋巴細胞、造血細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞、胚胎干細胞、CHO細胞、293細胞、各類昆蟲細胞、雜交瘤細胞、羊水細胞等培養(yǎng)基。第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一查閱說明書、咨詢供應(yīng)商；搜索ATCC或中科院細胞庫；查閱文獻；首選MEM做貼壁細胞培養(yǎng)、RPMI1640做懸浮細胞培養(yǎng)；在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。5如何選擇培養(yǎng)基第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一5如何選擇培養(yǎng)基第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一GlutaMAXL-丙氨酰-L-谷氨酰胺；具有熱穩(wěn)定性；在水溶液中更穩(wěn)定，不會自發(fā)降解；細胞可逐漸釋放氨肽酶，水解二肽，緩慢釋放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培養(yǎng)基中，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被細胞吸收利用。時效長；效果與添加L-谷氨酰胺相比略有延滯。第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一6平衡鹽溶液（BSS）維持滲透壓；緩沖調(diào)節(jié)溶液的酸堿度；供給細胞能量和無機離子；主要包括PBS、DPBS、Hank’s、DHank’s和Earle等。常用的DPBS和DHank’s：配方中無鈣鎂離子，不會中和胰酶及EDTA活性，用于細胞解離前的清洗、配制試劑。Hank’s、DHank’s：含酚紅、葡萄糖。PH：7.2～7.4第五十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一7消化液7.1胰酶使細胞間結(jié)合處蛋白降解，這時細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力作用下成為球形，從而使細胞分開；一般配制成0.1-0.25%濃度；配制時要用不含Ca2+

、Mg2+及血清的平衡鹽溶液；胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定；PH8.0、37℃作用能力最強。第五十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一7.2EDTA破壞細胞間的連接；常與胰酶配合使用；使用濃度為0.02%。第五十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一7.3膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶；作用溫和；不受Ca2+

、Mg2+及血清的抑制；常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%；Ⅰ：用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離；Ⅱ：適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織；Ⅳ：包含至少7種蛋白酶成分，能消化多種組織；Ⅴ：包含至少7種蛋白酶成分，胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個細胞。

第六十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一7.4中性蛋白酶中性金屬蛋白水解酶；細胞能保持完整，細胞膜無損；該酶非哺乳動物來源，不含支原體或動物病毒污染；對于溫度、pH的改變、以及血清成分都很穩(wěn)定；使用螯合劑或稀釋就能簡單滅活；使用濃度0.6-2.4U/ml。第六十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期一8抗生素青鏈霉素（雙抗