《生物免疫分析技術(shù)》課件

第四章生物免疫分析技術(shù)1編輯ppt免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛應用，它能夠用于測定人們希望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如現(xiàn)在人們所關(guān)注的食品安全性問題中一些物質(zhì)的檢測：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低成本的優(yōu)點；可對大量的樣品進行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠?qū)悠愤M行定量測定以確定樣品中待測組分的含量。2編輯ppt4.1免疫的原理Ag+AbAg－Ab特異性、靈敏性在Ag，Ab反應中，用容易示蹤的化學物質(zhì)標記一種反應物，以了解反應是否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對未知成分的樣品進行定性、定位及定量分析）。3編輯ppt4.2酶聯(lián)免疫法免疫酶技術(shù)：把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機地結(jié)合起來。它具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點，并克服上述兩種方法的缺點。酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫試驗，可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定量測定，所得結(jié)果比較客觀。4編輯ppt酶免疫測定或免疫酶技術(shù)是指酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應。它主要包括兩個方面：免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標記，與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學或電子顯微鏡觀察細胞及亞細胞水平的抗原或抗體。酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結(jié)合后，還保留其免疫活性，結(jié)合了作為標記的酶催化作用。5編輯ppt

ELISA的基本原理和方法

ELISA的種類和變化

ELISA的特點

ELISA的應用實例ELISA6編輯ppt4.2.1基本原理它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）7編輯ppt測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應結(jié)合后，再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。8編輯ppt顏色反應的深淺與相應的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反應的深淺來定量抗體或抗原。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。

其方法簡單，方便迅速，特異性強。9編輯ppt4.2.2酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應。10編輯ppt酶底物顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

11編輯ppt4.2.3ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA

12編輯ppt（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原13編輯ppt步驟：A將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B加入待檢標本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；C加入酶標記特異性抗體，溫育后清洗；D加入酶作用底物，產(chǎn)生顯色反應，顏色的改變與所加的待檢標本溶液中的抗原量成正比。14編輯ppt間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法15編輯ppt步驟：A將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；B加入待檢稀釋血清，若血清中有相應特異性抗體存在則與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；C加入酶標記的抗球蛋白抗體，此時酶標記抗抗體與吸附的抗原抗體復合物結(jié)合，溫育后清洗；D加入酶作用底物（或稱基質(zhì)），酶分解底物并顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可推知抗體量。16編輯ppt（三）競爭法

此法可用于檢測小分子抗原。17編輯ppt步驟：A將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；B將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原溶液以適當比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗；C加入酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反應。色深表示結(jié)合的酶標記抗原多，而待檢溶液中未標記的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標記抗原少，而待檢溶液中抗原量多。18編輯ppt對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。19編輯ppt4.2.4特點特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知,酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5～10μg/ml。20編輯ppt特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。

21編輯ppt例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應?？乖贵w反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。22編輯pptELISA應用實例23編輯ppt飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測24編輯ppt河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測：25編輯ppt

ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒

ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用

ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體26編輯pptELISA試劑盒商業(yè)資訊27編輯pptELISA試劑盒28編輯ppt29編輯ppt酶聯(lián)免疫井30編輯pptDNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀

DNM-9602A酶標分析儀幾種酶標分析儀31編輯ppt4.3放射免疫法放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應的特異性這兩大特點結(jié)合起來的免疫標記測定技術(shù)。其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、樣品用量少，而且不需要復雜的提純步驟。缺點是需要特殊的儀器設(shè)備和一定的防護條件，而且有些同位素標記物的半衰期較短以及試驗廢物難以處理，對環(huán)境造成放射性污染。32編輯ppt放射免疫測定法基本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗原對有限量抗體進行競爭性結(jié)合的基礎(chǔ)上。待測抗原是指人體內(nèi)某種微量活性物質(zhì)（如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上述物質(zhì)標記上放射性同位素，具有示蹤作用。33編輯ppt將標記抗原（Ag*）和未標記抗原（Ag）與特異性抗體（Ab）相混合，結(jié)果形成標記的和未標記的抗原抗體復合物。標記和未標記的抗原競爭與抗體進行結(jié)合的現(xiàn)象，成為競爭性抑制作用。

Ag*+AbAg*-Ab

標記抗原

特異性抗體

標記抗原抗體復合物+