考研rar等多個(gè)文件1生化

復(fù)習(xí)三蛋白質(zhì)一、概述二、結(jié)構(gòu)三、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系四、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)五、蛋白質(zhì)含量測(cè)定六、蛋白質(zhì)的分離提純一、概述（一）蛋白質(zhì)的重要作用；（二）蛋白質(zhì)的分類；（三）蛋白質(zhì)的元素組成（一）蛋白質(zhì)的功能1.催化功能-酶2.調(diào)控功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運(yùn)功能-膜蛋白、血紅蛋白4.運(yùn)動(dòng)功能-鞭毛、肌肉蛋白5.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架6.防御功能-免疫球蛋白（抗體、補(bǔ)體）7.信號(hào)傳遞-受體8.營養(yǎng)貯存-卵清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、酪蛋白9.異常作用-毒素1、依據(jù)外形分類球狀蛋白質(zhì)：globularprotein

外形接近球形或橢圓形，溶解性較好纖維狀蛋白質(zhì)：fibrousprotein

形似纖維或細(xì)棒，分可溶性/不溶性兩種膜蛋白質(zhì)：membraneprotein

親水性殘基少于胞質(zhì)蛋白（二）蛋白質(zhì)的分類2、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類簡單蛋白

simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成結(jié)合蛋白

conjugatedprotein由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成簡

單

蛋

白清蛋白和球蛋白

albuminandglobulin

廣泛存在于動(dòng)物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細(xì)胞核硬蛋白存在于軟骨、腱、毛發(fā)、絲等組織中，分為角/膠原/彈性/和絲蛋白等結(jié)

合

蛋

白色蛋白簡單蛋白+色素物質(zhì)如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素糖蛋白：簡單蛋白+糖類物質(zhì)脂蛋白：簡單蛋白+脂類結(jié)合核蛋白：簡單蛋白+核酸（三）元素組成蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物碳50％氫7％氧23％氮16%

硫0—3％其他微量蛋白質(zhì)的含氮量蛋白質(zhì)含量（克%）=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.25凱氏定氮法二、結(jié)構(gòu)（一）肽及肽平面（二）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念和測(cè)定方法（三）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)（四）蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵

（五）蛋白質(zhì)二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的概念；類型、穩(wěn)定因素（一）肽和肽平面由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基（酰）。1、肽：AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為Ser-Val-Tyr-Asp-Gln重要的肽：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

Glu------Cys------GlySH還原型谷胱甘肽

Glu------Cys------GlyS

SGlu------Cys------Gly

氧化型谷胱甘肽2、肽平面肽單位平面結(jié)構(gòu)的特征

單鍵可自由旋轉(zhuǎn)，雙鍵不能自由旋轉(zhuǎn)

肽鍵中C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，因此組成酰平面的原子處于同一平面原因：

C、O、N三個(gè)原子的電子共振

共振形式

酰胺平面與α－碳原子的二面角肽平面鍵長和鍵角一定肽鍵的原子排列呈反式構(gòu)型相鄰的肽平面構(gòu)成兩面角多肽鏈＝通過可旋轉(zhuǎn)的α-碳原子連接的酰胺平面鏈但這種旋轉(zhuǎn)是受到限制的共價(jià)主鏈

共價(jià)主鏈：由羧基C、氨基N及-Cα形成的鏈（二）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念(Primarystructure)（1）組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目.（2）多肽鏈的氨基酸順序，（3）多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。胰島素：A鏈：21個(gè)AAB鏈：30個(gè)AA

兩個(gè)鏈間二硫鍵一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵

（三）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)型：原子的連接方式構(gòu)象：原子的空間排布蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)（超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次（四）蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的作用力肽鍵、二硫鍵、酯鍵、配位鍵氫鍵、疏水作用、范德華力、離子鍵（1）肽鍵：（2）二硫鍵(DisulfideBond)：由含硫氨基酸形成。在蛋白質(zhì)分子中，起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用。二硫鍵被破壞，蛋白質(zhì)的生物活性喪失。（3）配位鍵(Metal-ionCoordination)：兩個(gè)原子之間形成的共價(jià)鍵，共用電子對(duì)由其中的一個(gè)原子提供。金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合往往是配位鍵，例如：鐵氧還蛋白、羧肽酶等。（4）酯鍵(EsterBond)：磷酸與含羥基氨基酸縮合形成磷酸酯鍵。（5）離子鍵

(Electrastaticattraction)又稱鹽鍵，一種具有相反電荷的兩個(gè)基團(tuán)之間的庫侖作用。這種鍵可以解離。（6)氫鍵(Hydrogenbond)氫鍵是由兩個(gè)負(fù)電性原子對(duì)氫原子的靜電引力所形成。X—H…Y它是質(zhì)子給予體X-H和質(zhì)子接受體Y之間的一種特殊類型的相互作用。（7)范德華力

(vanderWaalsforce)

這是一種普遍存在的作用力，是原子、基團(tuán)或分子之間比較弱的、非特異性的作用力。（8）疏水作用

(HydrophobicInteractions)

非極性側(cè)鏈在極性溶劑水中為了避開水相而彼此靠近所產(chǎn)生的一種作用力。主要存在蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)和酶的表面通常具有極性鏈或區(qū)域高分子的蛋白質(zhì)可形成分子內(nèi)疏水鏈、疏水腔或疏水縫隙，可以穩(wěn)定生物大分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

鍵能肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠(yuǎn)小于共價(jià)鍵，稱次級(jí)鍵次級(jí)鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因何在?數(shù)量巨大（五）蛋白質(zhì)二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的概念、類型、穩(wěn)定因素1、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(SecondaryStructure)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只涉及共價(jià)主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角。

螺距為0.54nm含3.6個(gè)氨基酸殘基13個(gè)原子3.613每個(gè)AA殘基占0.15nm轉(zhuǎn)1000肽鏈內(nèi)形成氫鍵通常，蛋白質(zhì)分子為右手-螺旋（1）-螺旋結(jié)構(gòu)

影響α螺旋形成的因素：

①R基的大?。狠^大的難形成，如多聚Ile②R基的電荷性質(zhì)：不帶電荷易形成③Pro：（1）-NH參與環(huán)的形成，C

-N不能旋轉(zhuǎn)（2）無法提供質(zhì)子，不能形成鏈內(nèi)氫鍵2008考題

由360個(gè)氨基酸殘基形成的典型

-螺旋，其螺旋長度是

A54nmB36nmC34nmD15nm（2）-折疊-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象；

-pleatedsheet在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm；-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直；-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。（3）β轉(zhuǎn)角

肽鏈主鏈骨架180°的回折結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由4個(gè)連續(xù)的AA殘基組成第一個(gè)殘基C=O第四個(gè)殘基NH形成氫鍵作用力是氫鍵只形成

O……（氫鍵）………H

—C—（NH—CH—CO）2—N—R這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。多數(shù)處在蛋白質(zhì)分子的表面。（4）無規(guī)卷曲

泛指不能歸入明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)如折疊片和螺旋的多肽片斷2、超二級(jí)結(jié)構(gòu)：若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元按照一定規(guī)律有規(guī)則組合在一起，相互作用，形成在空間構(gòu)象上可彼此區(qū)別的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合單位。

、

3、結(jié)構(gòu)域：二級(jí)或超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的特定區(qū)域。結(jié)構(gòu)域存在的原因：1、局域分別折疊比整條肽鏈折疊在動(dòng)力學(xué)上更為合理2、結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)域之間由肽鏈連接，有利于結(jié)構(gòu)的調(diào)整4、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(TertiaryStructure)是指在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用在空間進(jìn)一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu)。單鏈蛋白的最高級(jí)結(jié)構(gòu)是三級(jí)結(jié)構(gòu)球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的特征（1）含多種二級(jí)結(jié)構(gòu)元件（2）三維結(jié)構(gòu)具有明顯的折疊層次（3）分子是“緊密”的球狀/橢球狀實(shí)體——活性部位密度較低，有空間可塑性（4）疏水核和親水膜（5）表面空穴——營造疏水環(huán)境、活性功能部位

維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起著重要作用。

肌紅蛋白

153AA5、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)(QuaternaryStructure）指由多條各自具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基通過非共價(jià)鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式亞基：最小的單位通常稱為亞基或亞單位Subunit，它一般由一條肽鏈構(gòu)成，或是由二硫鍵連到一起的肽鏈構(gòu)成，單獨(dú)無生理活性。四級(jí)結(jié)構(gòu)就是各個(gè)亞基在這些蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系。維持亞基之間的化學(xué)鍵主要是疏水力。四級(jí)結(jié)構(gòu)中無二硫鍵由多個(gè)亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白。

亞基血紅蛋白血紅蛋白四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2；亞基：具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈單獨(dú)亞基無生物功能血紅蛋白研究對(duì)象：幾個(gè)亞基，相同否？怎樣連接

作用力：

穩(wěn)定四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：結(jié)構(gòu)互補(bǔ)（極性）和非共價(jià)鍵

主要是疏水作用判斷題：※球狀蛋白分子含有極性基因的氨基酸殘基在其內(nèi)部，所以能溶于水?！鞍踪|(zhì)的亞基和肽鏈?zhǔn)峭x的※疏水作用是使蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的一種非常重要的次要鍵

※蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)是第四度空間的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)因時(shí)間而變化的關(guān)系※蛋白質(zhì)分子中個(gè)別氨基酸的取代未必會(huì)引起蛋白質(zhì)活性的改變※二硫鍵和蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此沒有二硫鍵的蛋白質(zhì)就沒有三級(jí)結(jié)構(gòu)三、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

（三）空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

（一）多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

1、具相同序列的蛋白質(zhì)具相同的功能

名詞解釋：

來自不同生物體執(zhí)行但同一或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)；

同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，稱為序列同源性。

保守的氨基酸殘基為不變殘基

發(fā)生變化的氨基酸殘基為可變殘基

胰島素

51個(gè)殘基，24個(gè)不變殘基

尤其是6個(gè)Cys，以及由它們維持的3對(duì)二硫鍵

細(xì)胞色素C與系統(tǒng)樹

104個(gè)殘基，28個(gè)不變殘基

來自任兩個(gè)物種的細(xì)胞色素C的序列間的氨基酸差異數(shù)目與這些物種間的系統(tǒng)發(fā)生差異是成比例的，也即在進(jìn)化位置上相差愈遠(yuǎn)，其氨基酸序列之間的差別愈大。

細(xì)胞色素C的氨基酸序列差異可用于核對(duì)各個(gè)物種之間的分類學(xué)關(guān)系以及繪制系統(tǒng)樹或稱進(jìn)化樹。

狗人猴

馬騾

鯨兔豬袋鼠企鵝雞鴨響尾蛇龜蒼蠅蛾脈孢菌屬念珠菌屬面包酵母菌小麥牛蛙金槍魚動(dòng)物爬行動(dòng)物兩棲動(dòng)物魚哺乳動(dòng)物鳥昆蟲植物脊椎動(dòng)物從細(xì)胞色素C的一級(jí)結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化2008年考題簡述蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化的關(guān)系(8分）

2、一級(jí)結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致功能變化

———酶原激活胰島素前體胰島素原胰島素信號(hào)肽血液凝固與

氨基酸序列的局部斷裂

凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘难w蛋白網(wǎng)可溶性的血纖蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纖蛋白網(wǎng)3、一級(jí)結(jié)構(gòu)變異與分子病

分子?。河捎诨蛲蛔?，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的氨基酸種類發(fā)生變化，并引起功能降低或喪失。

鐮刀型貧血癥：血紅蛋白聚集為纖維狀鐮刀狀貧血病—血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細(xì)胞，患者因此缺氧窒息正常細(xì)胞鐮刀形細(xì)胞正常型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys---β鏈

谷氨酸鐮刀型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys---β鏈

纈氨酸谷A（極性）纈A（非極性）纖維狀沉淀結(jié)論：功能由關(guān)鍵部位的氨基酸決定

（三）空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

1、血紅蛋白與肌紅蛋白血紅蛋白4個(gè)亞基肌紅蛋白1條肽鏈

亞基血紅蛋白四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2；肌紅蛋白

血紅蛋白α

血紅蛋白β氨基酸序列大不相同，功能相似（載氧）說明：

空間結(jié)構(gòu)相似結(jié)構(gòu)決定功能2、肌紅蛋白對(duì)氧的結(jié)合很快達(dá)到飽和血紅蛋白對(duì)氧的結(jié)合能力與氧分壓有關(guān)

因?yàn)檠t蛋白具有4個(gè)亞基，有變構(gòu)現(xiàn)象，有緊張態(tài)和松弛態(tài)

氧結(jié)合引起的Hb的構(gòu)象變化變構(gòu)脫氧血紅蛋白氧合血紅蛋白對(duì)氧的親和力低對(duì)氧的親和力高氧合作用改變Hb四級(jí)結(jié)構(gòu)動(dòng)脈血中：氧分壓高，Hb為松弛態(tài)，有利于和氧結(jié)合組織深處：氧分壓低，Hb為緊張態(tài)，不利于和氧結(jié)合，有利于氧的釋放3、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性

變性定義：蛋白質(zhì)的次級(jí)鍵破壞,天然結(jié)構(gòu)解體,引起生物活性喪失,溶解度降低以及其它理化常數(shù)改變，但一級(jí)結(jié)構(gòu)沒有變化

變性因素：物理因素如熱、紫外線照射、高壓和表面張力；化學(xué)因素如有機(jī)溶劑、脲、胍、酸、堿、重金屬陽離子、生物堿試劑等變性表現(xiàn)：A.生物活性喪失B.一些側(cè)鏈基團(tuán)的暴露:更易與化學(xué)試劑反應(yīng)、C.一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變:疏水基外露,溶解度降低,一般在等電點(diǎn)區(qū)域不溶解,分子相互凝集,形成沉淀。如有變性劑則仍保持溶解狀態(tài)D.生物化學(xué)性質(zhì)的改變，分子結(jié)構(gòu)伸展，易被酶解

尿素/鹽酸胍競(jìng)爭主鏈氫鍵破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)有機(jī)溶劑SDS破壞分子內(nèi)疏水作用非極性基團(tuán)暴露強(qiáng)酸/堿破壞氫鍵、離子鍵重金屬陽離子與帶負(fù)電荷基團(tuán)結(jié)合不溶性金屬蛋白鹽生物堿試劑與帶正電荷基團(tuán)結(jié)合不溶性蛋白鹽

復(fù)性：當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)重新回復(fù)到天然結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。復(fù)性后的蛋白質(zhì)亦回復(fù)其生物活性，如核糖核酸酶吳憲

1.蛋白質(zhì)的功能是由空間構(gòu)象決定的2.蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是由關(guān)鍵部位的氨基酸順序決定的3.關(guān)鍵部位氨基酸的變化會(huì)引起功能發(fā)生變化四、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)（二）蛋白質(zhì)的電泳（三）蛋白質(zhì)分子的大小及測(cè)定（四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（五）蛋白質(zhì)的沉淀（六）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)（一）

蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)為什么蛋白質(zhì)具有兩性（酸、堿性）？含有酸堿氨基酸殘基堿/酸越大pI

？

越小pI通常在6.0左右

（二）蛋白質(zhì)的電泳蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)，遷移率由以下因素決定：所帶電荷分子量分子形狀（三）蛋白質(zhì)分子的大小及測(cè)定

蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬至一百萬道爾頓1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）變性后的肽鏈帶相同的電荷，均為線形分子，遷移率只和分子量有關(guān)凝膠法只適于球狀蛋白分子測(cè)量蛋白質(zhì)混合樣2、凝膠過濾法60000~80000轉(zhuǎn)/分重力60萬～80萬倍(3)沉降速度法（四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)膠體溶液的特點(diǎn)是什么？分子直徑在1-100nm內(nèi)，溶于水，且不易聚集沉淀（穩(wěn)定）。大多數(shù)球狀蛋白，分子直徑在膠體溶液范圍。溶于水，能形成穩(wěn)定的膠體溶液。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定的原因是什么？1.同種蛋白質(zhì)帶有同種電荷，相互排斥，與反離子構(gòu)成雙電子層；2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)（五）蛋白質(zhì)的沉淀

Pr從膠體溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解

——非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等

不可逆沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解——變性沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿試劑沉淀等Ⅱ1.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時(shí)，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，沉淀。分段鹽析法鹽析（（NH4）2SO4）

硫酸銨的優(yōu)點(diǎn)：

1、溶解度高，不受溫度影響

2、中性，不會(huì)引起pH發(fā)生變化

3、價(jià)廉2.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.等電點(diǎn)沉淀4.重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)（六）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)1、雙縮脲2、黃蛋白反應(yīng)3、茚三酮反應(yīng)尿素

雙縮脲

紫紅色絡(luò)合物雙縮脲反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)是含有跟雙縮脲一樣或近似結(jié)構(gòu)的化合物，如Pr(肽)，所特有的；此外含有一個(gè)肽鍵和一個(gè)結(jié)構(gòu)類似于肽鍵的化學(xué)鍵的化合物，也產(chǎn)生此反應(yīng)；NH3

也能跟Cu2+

產(chǎn)生暗藍(lán)色的絡(luò)合物：(暗藍(lán)色)

黃色反應(yīng)

含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸(Phe、Trp、Tyr)遇硝酸后可被消化成黃色物質(zhì)，此物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉（Phe不易消化，要見黃色反應(yīng)，需加少許濃硫酸）。

硝基酚(黃色)鄰硝醌酸鈉(橙黃色)五、蛋白質(zhì)含量測(cè)定（一）凱氏定氮法（二）紫外分光光度法（三）Lowry（福林-酚）法（四）考馬斯亮藍(lán)法（五）雙縮脲法Lowry（福林-酚）法

Tyr+福林酚試劑藍(lán)色深淺與含量存在線性關(guān)系。藍(lán)色化合物堿性條件（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）考馬斯亮藍(lán)顯色法原理考馬斯亮藍(lán)G－250與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收光的改變，從465nm變?yōu)?95nm；蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有較高的消光系數(shù)，蛋白最低檢出量為1微克，靈敏度高；反應(yīng)迅速，2min，且結(jié)合物在1h內(nèi)穩(wěn)定；干擾物質(zhì)少。六、蛋白質(zhì)的分離提純（一）概述（二）根據(jù)分子大小不同的純化方法（三）利用溶解度差別的純化方法（一）

概述總目標(biāo)：增加制品純度或比活1、前處理因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異

把蛋白質(zhì)從原來的組織或溶解狀態(tài)釋放出來，保持原來的天然狀態(tài)，并不丟失生物活性。常用的方法：勻漿器破碎、超生波破碎、纖維素酶處理以及溶菌酶等。超聲波破碎法：當(dāng)聲波達(dá)到一定頻率時(shí)，使液體產(chǎn)生空穴效應(yīng)使細(xì)胞破碎的技術(shù)。超聲波引起的快速振動(dòng)使液體局部產(chǎn)生低氣壓，這個(gè)低氣壓使液體轉(zhuǎn)化為氣體,

即形成很多小氣泡。由于局部壓力的轉(zhuǎn)換，壓力重新升高，氣泡崩潰。崩潰的氣泡產(chǎn)生一個(gè)振動(dòng)波并傳送到液體中，形成剪切力使細(xì)胞破碎。2、

粗分級(jí)

分離可用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大.3、細(xì)分級(jí)

樣品的進(jìn)一步純化。樣品經(jīng)粗分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。(二)根據(jù)分子大小不同的純化方法1.

透析

利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。2.

密度梯度離心

蛋白質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。3.

凝膠過濾

利用蛋白質(zhì)分子大小，因?yàn)槟z過濾所用的介質(zhì)是凝膠珠，其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同的分子大小的蛋白質(zhì)分子流過凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子進(jìn)入珠內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外隨溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動(dòng)并最先流出柱外，比網(wǎng)孔小的分子能不同程度底自由出入凝膠珠的內(nèi)外，由于不同大小的分子所經(jīng)路徑不同而得到分離。大分子先被洗脫下來。小分子后被洗脫(三)利用溶解度差別的純化方法1．等電點(diǎn)沉淀和pH的控制

蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最底點(diǎn)，利用等電點(diǎn)分離蛋白質(zhì)是一種常用的方法。2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析

中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽溶作用是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水相互作用加強(qiáng)了，因而溶解度增加

當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度開始下降。當(dāng)離子強(qiáng)度足夠高時(shí)，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。

鹽析作用的主要原因是大量中性鹽的加入使水的活性降低，原來溶液的大部分甚至全部的自由基水轉(zhuǎn)變成鹽離子的水化水，使蛋白質(zhì)表面疏水側(cè)鏈暴露例：用硫酸銨分離血清白蛋白和球蛋白一、目的要求

了解鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理及操作方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

在一定濃度的中性鹽作用下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷和水膜，則沉淀析出。這時(shí)所獲得的蛋白質(zhì)沉淀，能保留蛋白質(zhì)原來的性質(zhì)。蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中，其溶解度不同，例如球蛋白不溶于半飽和的硫酸銨溶液，在半飽和硫酸銨溶液中沉淀析出；而白蛋白則溶于半飽和的硫酸銨溶液，但不溶于飽和硫酸銨，在飽和的硫酸銨溶液中才沉淀析出，因此可以利用不同濃度的硫酸銨將血清或其他混合蛋白液中的白蛋白與球蛋白分離。三、儀器和試劑

1、儀器：試管和試管架、漏斗、定量濾紙。

2、試劑：血清、飽和硫酸銨溶液

四、實(shí)驗(yàn)步驟

取1：2稀釋血清2ml，加飽和硫酸銨溶液2ml，混勻，靜置10分鐘后過濾。取沉淀備用。

例：葡聚糖G25凝膠過濾去鹽一、目的要求

了解用葡聚糖G25凝膠過濾去鹽的基本原理和操作方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

葡聚糖G25凝膠是一種“分子篩”的分離法，當(dāng)欲分離的物質(zhì)通過葡聚糖G25凝膠時(shí)，分子量大的物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）沿凝膠顆粒間隙隨溶劑流動(dòng)，流程短，移動(dòng)速度快先流