蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化第一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié):蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性一.蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性:蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響,保持其生物活力的能力。第二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素:

1.金屬離子、底物、輔因子和其他相對低分子質(zhì)量配體的結(jié)合作用

金屬離子由于結(jié)合到多肽鏈的不穩(wěn)定部分（特別是彎曲處），因而可以顯著增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。當(dāng)酶與底物、輔因子和其他低相對分子質(zhì)量配體相互作用時，也會看到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加。第三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用

由于蛋白質(zhì)分子表面上既有疏水簇，也有極性和帶電基團。從熱力學(xué)上看，疏水簇與水的接觸對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是不利的。所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物時，脂分子或蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定到疏水簇上，因而防止疏水簇與溶劑的接觸，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域。第四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

3.鹽橋和氫鍵

鹽橋：當(dāng)一個氨基酸的氨基和與它空間相鄰的另一個氨基酸的羧基互相靠近時，形成鹽橋。

-COO.......H3N-

蛋白質(zhì)中鹽橋的數(shù)目較少，但對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性作用很顯著。第五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

氫鍵：是通過氫原子參與成鍵的特殊形式的化學(xué)鍵。當(dāng)一個電負性較強的原子與氫鍵合后，繼續(xù)與另一個電負性較強的原子鍵合：

氫鍵能維持二級結(jié)構(gòu)(如α-螺旋，β-片層，β-轉(zhuǎn)角等）。但是氫鍵對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要性不應(yīng)估計過高。

第六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

4.二硫鍵

二硫鍵：即S－S鍵，是2個巰基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的共價鍵。鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵：

第七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一由于交聯(lián)即蛋白質(zhì)中形成二硫鍵，伸展蛋白質(zhì)的熵急劇降低，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。與此類似，用雙功能試劑實現(xiàn)分子內(nèi)交聯(lián)，也能使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定化。第八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

日常生活中的燙發(fā)和發(fā)型保持，主要原理是操縱毛發(fā)角蛋白二硫鍵的還原和再氧化，即二硫鍵的斷開和重新鍵合。第九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

5.對氧化修飾敏感的氨基酸含量較低

蛋白質(zhì)中一些結(jié)構(gòu)比較重要的氨基酸殘基（如活性部位的氨基酸）的氧化作用是蛋白質(zhì)失活的重要原因。因此要減少這類對氧化修飾敏感的氨基酸含量，從而提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。第十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一6.氨基酸殘基的堅實裝配溶液中的蛋白質(zhì)似乎裝配緊密，其緊密程度類似于低相對分子質(zhì)量化合物的晶體狀態(tài)，盡管如此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中仍有空隙。空隙中充滿水分子，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，因此除去孔隙中的水分子，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更堅實，穩(wěn)定性也增加。第十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一7.疏水相互作用疏水性大小與穩(wěn)定性沒有必然的聯(lián)系非極性氨基酸在蛋白質(zhì)球體內(nèi)的規(guī)則的排列是穩(wěn)定性的原因之一增加疏水作用是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的實用方法:1.降低蛋白質(zhì)表面的疏水性；

2.增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性第十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一有3個主要因素不利于疏水相互作用：

1.蛋白質(zhì)球體中的氨基酸必須相當(dāng)緊密地堆積；

2.影響氨基酸幾何形狀和能量的微環(huán)境；

3.蛋白質(zhì)多肽鏈折疊時需要疏水簇仍保持在蛋白質(zhì)表面，因為在體內(nèi)，疏水簇負責(zé)蛋白質(zhì)與其他分子的疏水相互作用。第十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一二.測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法比較蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的準則包括:1.熔化溫度Tm;蛋白質(zhì)伸展一半時的變性劑濃度2.蛋白質(zhì)自由能;3.最大穩(wěn)定性溫度(Ts);4.在特定溫度下蛋白質(zhì)功能活性維持時間.第十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一熔化溫度Tm和蛋白質(zhì)伸展50%時的變性劑濃度是預(yù)測酶穩(wěn)定性的最有用參數(shù);1.Tm:

蛋白質(zhì)受熱伸展過渡中點時的溫度;2.變性劑濃度:蛋白質(zhì)加變性劑伸展過程中使蛋白質(zhì)伸展一半時所需要的變性劑濃度;第十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)：蛋白質(zhì)失活的原因和機理一.蛋白水解酶和自溶作用

1.酶在使用和貯存過程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的結(jié)果。蛋白水解酶可催化肽鍵水解。

2.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物也是一種蛋白水解酶時，就會發(fā)生自我降解現(xiàn)象，叫做自溶。第十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一二.聚合作用：蛋白質(zhì)發(fā)生可逆性伸展→→伸展的蛋白質(zhì)分子彼此締合

→→可能發(fā)生蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成從而使蛋白質(zhì)沉淀析出.

第十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)的聚合作用和沉淀的區(qū)別：

1.蛋白質(zhì)的聚合作用可能是可逆的,并不一定是不可逆的.

2.沉淀作用意味著蛋白質(zhì)并未發(fā)生顯著的構(gòu)象變化即從溶液中析出。因此，沉淀很容易再溶于水溶液中，并恢復(fù)其全部天然特性。第十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

三、極端pH:

極端pH下引起蛋白質(zhì)變性的重要因素是：一旦遠離了蛋白質(zhì)的等電點的，那么蛋白質(zhì)分子內(nèi)相同電荷間的靜電斥力會導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展。從而使埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部非電離殘基發(fā)生電離，導(dǎo)致失活。

pH的變化可以引起蛋白質(zhì)的伸展,這個過程原則上是可逆的,但這些變化常能導(dǎo)致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.第十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一四、氧化作用:

各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基，從而使蛋白質(zhì)變性。分子氧、H2O2和氧自由基是常見的蛋白質(zhì)氧化劑。五、表面活性劑和去污劑

表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質(zhì)發(fā)生強烈的相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性.其中陰離子去污劑的作用比陽離子和非離子去污劑強烈.第二十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一六、變性劑：

1.脲和鹽酸胍:機制尚不明確,可能是消除了維持三級結(jié)構(gòu)的疏水作用力或直接與蛋白質(zhì)分子作用.

2.高濃度鹽：高濃度鹽既有穩(wěn)定作用也有變性作用，這要看鹽的性質(zhì)和濃度。

3.螯合：常常不可逆地失活需要金屬輔因子的酶，但可穩(wěn)定不需要金屬輔因子的酶；

4.有機溶劑：改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù);增加疏水核的溶解度,降低帶電表面的溶解度;奪去酶分子表面的必需水而使酶失活.第二十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一七、重金屬離子和巰基試劑:

與蛋白質(zhì)的巰基、二硫鍵以及色氨酸、組氨酸殘基反應(yīng)。八、熱:

熱失活是工業(yè)上最經(jīng)常遇到的酶失活的原因.熱失活分二步過程:伸展---不可逆失活.九、機械力：

振動、剪切、超聲波、壓力都可能引起蛋白質(zhì)的變性。這種變性理論上是可逆的，但也可能伴隨著其他反應(yīng)而不可逆地失活.

第二十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一十、冷凍和脫水：

冷凍和脫水時，溶質(zhì)被濃縮，引起酶微環(huán)境中pH和離子強度的劇烈改變，減弱疏水相互作用,并可能引起二硫交換和巰基的氧化。十一、輻射作用:

輻射可產(chǎn)生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或間接地作用于蛋白質(zhì)分子.第二十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化

酶的穩(wěn)定化方法

固定化非共價修飾化學(xué)修飾④蛋白質(zhì)工程第二十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一一固定化固定化可通過下列效應(yīng)影響酶的穩(wěn)定性：

空間障礙：由于空間障礙可以防止蛋白水解酶的作用，阻擋酶與化學(xué)失活劑的接觸，同時阻礙氧向酶的擴散可以保護對氧不穩(wěn)定的酶

擴散機制:使酶發(fā)生交聯(lián)或包埋在載體緊密的孔中可以使酶的構(gòu)象更加堅牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡。第二十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一一酶固定到載體上后可產(chǎn)生空間障礙，結(jié)果其他大分子難于與酶作用，因此，固定到載體上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，這也是防止蛋白水解酶自溶的原因二底物、配體和氫離子濃度在載體附近和整體溶液之間的分布不均一，造成載體周圍的局部濃度與整體濃度不同，也就是酶的微環(huán)境發(fā)生了變化第二十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一三當(dāng)酶包埋在多孔顆粒內(nèi)，底物必須先擴散到顆粒表面（外部質(zhì)量傳遞），然后進入顆粒內(nèi)部（內(nèi)部質(zhì)量傳遞），酶才能與其作用，這些擴散限制可明顯使固定化酶“穩(wěn)定化”外擴散：底物必須從流動的水溶液傳遞到固定化酶顆粒外表面內(nèi)擴散:底物進一步傳遞到固定化酶顆粒內(nèi)部第二十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一四將酶多點共價連接到載體表面，或用雙功能試劑交聯(lián)酶，或?qū)⒚赴裨谳d體緊密的孔中，可以使酶構(gòu)象更加堅牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡。

A

B

CA.用多功能試劑交聯(lián)；B.共價或非共價連于載體上

C.包埋到載體的緊密孔中

第二十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

二、非共價修飾反相膠束添加劑蛋白質(zhì)間非共價相連，形成的多聚體或者聚合體的活力和穩(wěn)定性常比單體高第二十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

反膠束是由兩性化合物在占優(yōu)勢的有機相中形成的。它不僅可以保護酶，還能提高酶活力，改變酶的專一性。

反相膠束示意圖

第三十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一添加劑專一性底物及配體;非專一性中性鹽和多羥基物質(zhì);與失活劑競爭的物質(zhì)或除掉破壞化學(xué)催化劑的物質(zhì)第三十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一添加劑不僅可以提高酶的熱穩(wěn)定性，還可提高酶的抗蛋白水解，抗化學(xué)試劑，抗PH變化，抗變性劑，抗稀釋作用

例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羥基化合物，能形成很多氫鍵，并助于形成“溶劑層”，增加表面張力和溶液黏度，這類添加劑通過對蛋白質(zhì)的有效脫水，降低蛋白質(zhì)水解作用而起穩(wěn)定酶的作用第三十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)非共價相連蛋白質(zhì)間相互作用時，由于從蛋白質(zhì)表面相互作用區(qū)域排除水，因而降低自由能，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定酶形成的多聚體或聚合體的活力和穩(wěn)定性也常比其單體高

第三十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一三、化學(xué)修飾化學(xué)修飾即修飾作用可達到穩(wěn)定酶的作用，得到可溶性穩(wěn)定化酶。

1.可溶性大分子修飾酶：聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等多糖以及白蛋白，多聚氨基酸

2.小分子修飾酶第三十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一原因：修飾有時會獲得不同于天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的更穩(wěn)定的構(gòu)象；修飾關(guān)鍵功能基團也會達到穩(wěn)定化；由化學(xué)修飾引入到蛋白質(zhì)的新的功能基團有可能形成附加氫鍵或鹽鍵；用非極性試劑修飾可加強蛋白質(zhì)中疏水相互作用；蛋白質(zhì)表面基團的親水性；交聯(lián)酶晶體第三十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一酶的失活和再活化對于可逆性酶，可以采取相應(yīng)措施實現(xiàn)其再活化例如：用過量的碘離子使脲酶重新天然化，該酶失活是由于重金屬陽離子使巰基中毒引起，再活化的機理是碘離子與結(jié)合的金屬離子形成碘結(jié)合物

對于不可逆變性酶，可用下述方法進行再活化：用變性劑使固定化酶伸展成無規(guī)則盤繞狀態(tài)第三十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一最新進展可將變性的蛋白質(zhì)分子孤立在反膠束內(nèi)，蛋白質(zhì)在反相膠束內(nèi)可重新折疊成天然狀態(tài)，而且沒有與其他變性分子接觸和聚合，此膠束由表面活性劑穩(wěn)定的水滴構(gòu)成，并懸浮于異丁烷中。第三十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)各種酶穩(wěn)定化方法的比較比較各種不同的酶穩(wěn)定化方法是困難的，因此制定的了一下一般的標(biāo)準：①穩(wěn)定性至少要增加1~3個數(shù)量級②應(yīng)對各種酶失活因素(物理，化學(xué)及生物學(xué)因素)③穩(wěn)定化不應(yīng)減少酶活力或改變酶的專一性④穩(wěn)定化方法適合各類蛋白質(zhì)⑤穩(wěn)定化方法應(yīng)在體內(nèi)，體外都適用⑥從經(jīng)濟角度看，方法應(yīng)具有方法的潛力第三十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)工程定義以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過化學(xué)、物理和分子生物學(xué)的手段進行基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程第三十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)工程的基本目標(biāo)：

是按預(yù)期的結(jié)構(gòu)和功能，通過分子設(shè)計和DNA重組技術(shù)，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。優(yōu)點：提供了有目的改變酶性能的可能性，不僅改變酶的結(jié)構(gòu)，也可以改變其催化活力及專一性和穩(wěn)定性。第四十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程方法

①DNA改組技術(shù)②定點突變技術(shù)③組合設(shè)計④理性設(shè)計第四十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一DNA改組技術(shù)的定義

DNA改組(DNAshuffling),也稱分子育種(molecularbreeding)或有性PCR(sexualPCR),是以單個基因或多個同源基因(一般為天然存在的基因家族)為模板,將其切割成一系列隨機大小的DNA小片段,然后在體外通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)將這些片段隨機重組成全長基因,實現(xiàn)同源基因重組,達到分子進化目的的一種技術(shù)。第四十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一隨著突變方法、突變體高通量篩選技術(shù)、基因結(jié)構(gòu)與功能研究的突破，特別是PCR技術(shù)的進一步成熟，DNA改組技術(shù)(DNAshuffling)更加成熟，使得DNA改組成為蛋白質(zhì)體外分子進化的主流技術(shù)。DNA改組技術(shù)具有許多重要優(yōu)點，例如不需要事先了解結(jié)構(gòu)信息，也不需要了解蛋白質(zhì)的功能關(guān)系，其缺點是需要配合快速、可靠的鑒別突變體的方法。第四十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一定點突變技術(shù)(Site-directedmutagenesis)是在已知蛋白質(zhì)中取代、插入或刪除特定的氨基酸殘基，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和對應(yīng)功能，又被稱為理性設(shè)計(rationaldesign)。它可以作為DNA改組技術(shù)的有益補充，是基于基因和蛋白質(zhì)信息進行基因和蛋白質(zhì)序列的改造，通過定點突變使得所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的特征改變。第四十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

組合設(shè)計（combinationaldesign）和數(shù)據(jù)驅(qū)動設(shè)計（data-drivendesign）是另外兩種最新的可以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程技術(shù)。第四十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

組合設(shè)計:

是通過一種策略使得在基因水平上產(chǎn)生差異化，同時，通常需要大量的高通量篩選來鑒別設(shè)計是否獲得成功。組合設(shè)計方法的目標(biāo)在于通過在蛋白質(zhì)隨機位點引入隨機突變（randommutation）來提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

第四十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一組合設(shè)計方法的優(yōu)點：在于不像理性設(shè)計那樣需要詳細的蛋白質(zhì)殘基信息和知識。不過，從大量的組合產(chǎn)生的變異體集合中，有效鑒別穩(wěn)定性提升的蛋白質(zhì)是極為重要的，因此篩選工作非常重要。第四十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一數(shù)據(jù)驅(qū)動設(shè)計：

以不斷增加的、相同功能的氨基酸序列以及核苷酸的可用性為基礎(chǔ)的。它通過利用有效的數(shù)據(jù)來選擇蛋白質(zhì)的目標(biāo)區(qū)域，減少數(shù)據(jù)庫數(shù)量，而不需要指出精確的變化。

第四十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一

數(shù)據(jù)驅(qū)動設(shè)計的優(yōu)點：通過將理性設(shè)計方法的小數(shù)據(jù)庫數(shù)量和缺乏設(shè)計突變所需要的指定信息合并，數(shù)據(jù)驅(qū)動方法最近被用來促進篩選過程。通過考慮可獲得的有用數(shù)據(jù)（如結(jié)構(gòu)和序列信息），減少序列空間，篩選變體數(shù)量。第四十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一第六節(jié)蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)的糖基化修飾是廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾形式之一，在決定蛋白質(zhì)功能以及保護蛋白質(zhì)免受熱力學(xué)降解方面發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)糖基化的分類：①O-糖基化②N-糖基化第五十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期一糖基化位點的確定方法①PNGaseF酶法

當(dāng)前，因操作方法極為穩(wěn)定，被應(yīng)用最為廣泛的N-糖蛋白鑒定方法就是PNGaseF酶法。其原理是當(dāng)天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼釙r，相對分子質(zhì)量會增加0