蛋白樣本制備與Western

第一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二主要內(nèi)容蛋白樣本制備的目的1蛋白樣本制備總體原則和策略2案例分析—細胞總蛋白的提取3成功的WesternBlot6蛋白提取產(chǎn)品選擇指南4蛋白定量方法的選擇5第二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二一蛋白樣本制備成功蛋白分析的基礎蛋白樣本activityassaysproteinmicroarraysSDSimmunoblottingmassspectrometry2-DE/IEFEMSAELISA蛋白樣本制備的目的:后續(xù)應用第三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二二蛋白樣本制備的原則蛋白樣本制備原則方法應具備標準化，具有重現(xiàn)性、可靠性、簡便性；盡量抽提完全；應使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止在抽提過程中發(fā)生化學修飾如做2D則需去除高豐度蛋白或無關蛋白必要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。第四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二二蛋白樣本制備的策略制備蛋白的目的活性分析免疫印跡雜交

免疫沉淀或共沉淀1D2DEMSACHIP等實驗材料細胞組織固定組織或石蠟包埋組織微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白樣本等目的蛋白的結(jié)性質(zhì)與分布分布于胞槳/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四級結(jié)構(gòu)特征磷酸化等修飾……方法的選擇

1自行配制抽提試劑,根據(jù)文獻方法或經(jīng)驗提取2購買商品化試劑盒,按其說明書的方法提取第五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二三案例分析--細胞中總蛋白的制備高速離心收集上清即得全蛋白樣本細胞加入裂解液冰上放置10-15分鐘蛋白定量和SDS檢測裂解樣品離心收集定量檢測第六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點表面活性劑緩沖液蛋白酶抑制劑磷酸酶抑制劑其它：H2O、NaCl、等還原劑RIPABuffer第七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點

緩沖液Tris-HCl（pH7.5),提供pH環(huán)境，使蛋白保持穩(wěn)定，增加溶解性。第八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點表面活性劑溶解膜與脂膜，溶解與穩(wěn)定蛋白質(zhì)（特別是膜蛋白）分為離子型（如SDS、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。第九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二各類表面活性劑特點

1陰離子型:SDS脫氧膽酸鹽

2陽離子型:

CPB和CTAB3雙性離子型:CHAPSZwittergent系列

4非離子型:Brij系列

Triton-100NonidetP40Tween系列等第十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二選用表面活性劑考慮的因素參考文獻報告保持生物活性時使用的表面活性劑選用表面活性劑考慮的因素工作條件下表面活性劑的溶解性使用分子生物學級的表面活性劑,無核酸酶蛋白酶等根據(jù)樣本下游的應用來選擇表面活性劑的種類考慮表面活性劑的去除方法表面活性劑的純度影響提取蛋白的質(zhì)量保護蛋白活性時,不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度盡量使用毒性較低的表面活性劑因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進行分離使用非表面活性劑NDSB結(jié)合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性有時比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析,常先用一種表面活性劑將蛋白溶解,而另一種表面活性劑取代進行蛋白的后續(xù)分析第十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二去除未結(jié)合的表面活性劑1疏水吸附方法HydrophobicAdsorption

2透析法Dialysis3凝膠層析法

GelChromatography4離子交換層析Ion-exchangeChromatography

根椐表面活性劑的疏水性,CMC,凝聚數(shù)目,和電荷等性質(zhì)來去除.

第十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點蛋白酶抑制劑抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨時加入第十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二蛋白酶抑制劑第十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點磷酸酶抑制劑抑制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使用前臨時加入。第十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二磷酸酶抑制劑選擇磷酸酶主要包括非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶，酸性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。常規(guī)的抑制劑主要包括：

試劑名稱抑制作用氟化鈉酸性磷酸酶，絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶正釩酸鈉堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸鈉絲氨酸-蘇氨酸磷酸第十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點還原劑防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，保護二硫鍵。DTT、β－巰基乙醇等。.第十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點其它水；溶劑NaCl：第十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二全蛋白抽提時注意事項可以適量加入甘油,穩(wěn)定蛋白注意事項可以適量加入Benzonase/DNaseI等核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷酸酶使用的Detergent的種類純度濃度干擾去除等因素Temperature試劑和器皿冰上預冷,低溫4℃操作細胞或組織的樣本量裂解液的用量第十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二細胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技術(shù)要點第二十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二四蛋白樣本制備產(chǎn)品選擇指南第二十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二核蛋白樣本制備抽提原理低滲裂解細胞膜,釋放出胞漿蛋白與胞核;離心分離出胞核;高滲破裂胞核,釋放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,釋放出DNA結(jié)合蛋白(組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子)實驗注意事項試劑和器皿冰上預冷裂解液的用量細胞總量抑制蛋白酶蛋白酶抑制劑第二十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二膜蛋白樣本制備第二十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二膜蛋白的抽提方法及原理方法多直接抽提法分級抽提法

1:先機械法等非表面活性劑方法裂解細胞,再用表面活性劑抽提

2:按溶解性分級抽提

3:按亞細胞分級抽提

產(chǎn)物細胞膜蛋白細胞器質(zhì)膜蛋白注意事項根椐膜蛋白種類和后續(xù)研究目的的不同,選擇不同的產(chǎn)品或表面活性劑變性劑等.抑制蛋白酶.樣本量第二十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二膜蛋白的直接提取第二十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二蛋白的分級提取按蛋白溶解度不同進行分級抽提,降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)第一步：用非表面活性劑溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)；第三步：用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。第二十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二亞細胞分級抽提用超離心技術(shù)分離出細胞器、質(zhì)膜和細胞核等成分，再用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。根椐胞漿/胞膜/胞核/骨架蛋白的亞細胞策略用不同提取液逐級溶解第二十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二四種亞細胞組分分離提取的結(jié)果第二十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二線粒體蛋白樣本制備首先用密度梯度離心方法分別分離出線粒體,胞質(zhì),胞核.再用線粒體抽提Buffer溶解線粒體蛋白.第二十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二蛋白抽提產(chǎn)品哺乳動物蛋白抽提試劑盒（CW0002）組織蛋白抽提試劑盒（CW0004）真核膜蛋白抽提試劑盒（CW0005）細菌蛋白抽提試劑盒（CW0001）酵母蛋白抽提試劑盒（CW0003）植物蛋白抽提試劑盒（CW2033）Nc-細胞核/漿蛋白抽提試劑盒（CW0006）第三十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二五蛋白定量產(chǎn)品選擇指南第三十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二BCA法蛋白定量（CW0014）BCA（bicinchoninicacid）是理想的蛋白質(zhì)定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質(zhì)檢測的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質(zhì)的影響。在組織細胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑SDS，TritonX-100，Tween不影響檢測結(jié)果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會對檢測結(jié)果有一定影響。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford法測定蛋白濃度。第三十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二Bradford法蛋白定量（CW0013）

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）干擾此法的測定。

第三十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二Lowery法蛋白定量（CW0015）Lowry法蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。第三十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二六成功的WesternBlotDiagram通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進行檢測，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白

原理第三十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二六成功的WesternBlot二抗孵育蛋白提取與定量一抗孵育封閉轉(zhuǎn)膜SDS蛋白變性顯影第三十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二蛋白變性Tris-cl(PH6.8)

SDS

GlycerolBromphend-blue

β-巰基乙醇

DTT高溫變性,形成蛋白質(zhì)-SDS膠束加入Samplebuffer沸水浴5min第三十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠加速劑催化劑單體交聯(lián)劑緩沖液Tris-Cl四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（Acr）過硫酸胺或核黃素（AP）甲叉雙丙烯酰胺（Bis）第三十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮PH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離PH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系統(tǒng)。第三十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS-聚丙烯酰胺凝膠最佳分離范圍不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應選用不同的凝膠濃度。第四十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺分離膠配方第四十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS灌制分離膠隔絕空氣灌好后一般室溫放置30－40分鐘第四十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠配方第四十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS灌制積層膠插入梳子第四十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二SDS膠制備注意事項過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用，如連續(xù)實驗可在4度放置2－3天。配制30％丙烯酰胺儲存液要過濾。配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠出現(xiàn)濃度不均的情況。要根據(jù)溫度調(diào)整TEMED的使用量。水封的時候水要慢慢加入，太快會導致膠面不平。插梳子的時候要用力均勻，一次成型。在上樣前可20V恒壓預電泳20分鐘，可去除泳道中的雜質(zhì)。第四十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二上樣及電泳提前將樣品沸水浴5分鐘，12000－14000rpm離心5分鐘。根據(jù)自己的設計上樣。80V恒壓跑濃縮膠。看溴酚藍壓縮成一條線后把電壓調(diào)為100V。當溴酚藍跑至離膠的下面還有0.4－0.6mm時停止電泳。第四十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜

蛋白質(zhì)帶負電荷，凝膠在負極一側(cè)，膜在正極一側(cè)，接通電源以后，蛋白質(zhì)由負極向正極轉(zhuǎn)移至膜上。第四十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜第四十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜注意事項PVDF膜要預先用甲醇活化；NC膜要預先泡水，除去中間的氣泡。然后在轉(zhuǎn)膜也中平衡20分鐘。膜、膠、濾紙夾好后要將中間的氣泡全部趕出來，否則有氣泡的地方就會斷路，蛋白無法轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜要在冰浴中進行，防止散熱量太大導致轉(zhuǎn)膜溫度過高。根據(jù)蛋白分子量大小選擇適合的轉(zhuǎn)膜條件。分子量（kd）轉(zhuǎn)膜條件<20200mA恒流1小時20-100200mA恒流2小時100-200200mA恒流6小時或30V恒壓過夜>200同上，可在轉(zhuǎn)膜液中加0.1％SDS第四十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二膜的封閉

為避免膜與作為檢測試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理,一般用5％的脫脂奶粉或者3％的BSA室溫或37度封閉2小時。第五十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)好蛋白的膜ProteinProtein第五十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二封閉ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgent第五十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二一抗孵育ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentPrimaryAntibody第五十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二二抗孵育ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentEEPrimaryAntibodySecondaryAntibody第五十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二顯影ProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentEEPrimaryAntibodySecondaryAntibody－Enzyme(E)sssssPPPPSubstrate第五十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二顯色方法HRP酶促底物直接顯色第五十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二顯色方法—化學發(fā)光

cECL低背景(CW0048)eECL高靈敏型(CW0049)主要優(yōu)點適用于HRP檢測的最靈敏的化學發(fā)光底物適用于HRP檢測的最靈敏的化學發(fā)光底物檢測下限10-12g10-15g信號持續(xù)時間8小時8小時首選檢測方法成像設備或X膠片成像設備或X膠片建議一抗稀釋度0.2ug-1ug/ml50ng-1ug/ml建議二抗稀釋度10ng-50ng/ml5ng-50ng/ml產(chǎn)品保存期室溫1年4℃1年建議印跡膜硝化纖維或PVDF硝化纖維或PVDF第五十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二成功的要素質(zhì)優(yōu)量足的蛋白樣本科學的對照正確的抗體選擇保存和使用細致的實驗操作步步監(jiān)測第五十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二科學的對照蛋白Marker：預染或非預染各種分子量的蛋白，用于標示電泳中蛋白的大小和示蹤陽性對照：目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質(zhì)量和效率

陰性對照：非目的蛋白或明確不表達目的蛋白組織或細胞的蛋白提取物，用于檢驗抗體的特異性

二抗對照：不加一抗，用于檢驗二抗的特異性內(nèi)參對照：管家基因編碼的、很多組織和細胞中都穩(wěn)定表達的蛋白，用于檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達量的標準對照

空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果第五十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二蛋白Marker中分子量CW0142可視型中分子量CW0139藍色預染中分子量CW0140可視型藍色預染中分子量CW0141彩虹預染中分子量CW0177Western中分子量CW0021Western中低分子量CW2014第六十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)antibody[AC-15](ab6276)at1/5000dilution,Lysates/proteinsat20ugperlane

Lane1:HeLanuclear

Lane2:HeLawholecelllysate

Lane3:A431celllysate

Lane4:Jurkatcelllysate

Lane5:HEK293celllysate.WB內(nèi)參對照CW0081第六十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期二正確的抗體選擇保存和使用一抗的選擇:

1、樣本的種屬

2、適用于WB實驗方法

3、單克隆抗體經(jīng)親和純化的多克隆抗體二抗的選擇與一抗種屬匹配

HRP標記的

重鏈＋輕鏈全長的、Fab段的以及Fc段的抗體的保存和使用：

1、按說明書的要求分裝保存；避免反復凍融

2、工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，4度不超過2周

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