血紅蛋白提取和分離

血紅蛋白提取和分離第一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一知識回顧--------有關蛋白質(zhì)的幾個問題：1、含量2、組成元素3、相對分子質(zhì)量4、基本組成單位：結(jié)構(gòu)簡式：種類：5、氨基酸連接方式

占細胞干重的50％以上，細胞中含量最多的有機物C、H、O、N高分子化合物氨基酸NH2RHCCOOH脫水縮合第二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一知識回顧--------有關蛋白質(zhì)的幾個問題：6、肽鍵7、分子結(jié)構(gòu)8、蛋白質(zhì)多樣性的原因：(多樣性的根本原因)

9、蛋白質(zhì)的鑒定方法氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（n條）CONH氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別10、生理功能細胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動的主要承擔者第三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一基礎知識1.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。第四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一閱讀并回答（P64）1、凝膠色譜法另一個名稱；2、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)；3、凝膠的實質(zhì)；4、凝膠色譜法

5、凝膠色譜法的原理?；A知識（一）凝膠色譜法第五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一1、凝膠色譜法的別名：分配色譜法

是根據(jù)相對分予質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。4、凝膠

①性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通道；

②化學本質(zhì)：多糖類化合物：③實例：葡聚糖、瓊脂糖：2、凝膠色譜法的概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離?；A知識（一）凝膠色譜法3、依據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。第六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一基礎知識（一）凝膠色譜法5、具體過程第七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快基礎知識（一）凝膠色譜法第八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一1、緩沖物質(zhì)有哪些？2、緩沖溶液的作用是什么？3、怎樣配制緩沖溶液？基礎知識（二）緩沖溶液第九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一1、緩沖溶液概念在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的PH值的影響，維持PH基本不變。2、緩沖溶液作用基礎知識（二）緩沖溶液3、緩沖溶液配制通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。第十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一思考：

你認為在血紅蛋白整個實驗中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？

使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性)?；A知識（二）緩沖溶液第十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一閱讀第65頁的相關內(nèi)容，回答以下問題：1、電泳的概念；2、電泳的原理；3、電泳的種類；4、SDS的作用?；A知識（三）電泳第十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一1、概念帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程?；A知識（三）電泳在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。第十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一基礎知識（三）電泳

2、原理：許多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，這些基團會帶上（）。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其（）移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子（）以及分子本身（）、（）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（），從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。多肽、核酸可解離的基團正電或負電所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度一定的PH第十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一⑶.常見電泳類型：①瓊脂糖凝膠電泳②聚丙稀酰胺凝膠電泳③SDS——聚丙稀酰胺凝膠電泳遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小、形狀。電泳遷移率完全取決于分子的大小?；A知識（三）電泳第十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是()。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS單條肽鏈的分子量分子的大小第十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一實驗操作閱讀課本相關內(nèi)容，思考以下問題：1、蛋白質(zhì)的提取和分離一般分成幾步？2、樣品怎樣處理？3、蛋白質(zhì)怎樣分離？第十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一實驗操作（一）樣品處理問：蛋白質(zhì)提取和分離步驟？（1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白的釋放；離心等操作收集血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。第十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）2個a－肽鏈2個β一肽鏈4個亞鐵紅素基團①血液組成實驗操作（一）樣品處理第十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一血液由血漿和各種血細胞組成，其中紅細胞最多。在紅細胞的組成中，約90％是血紅蛋白。血紅蛋白由四個肽鏈組成(如圖)，包括兩個α-肽鏈和兩個β-肽鏈。其中每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳。血紅蛋白因含有血紅素而呈現(xiàn)紅色。血紅蛋白2個a－肽鏈2個β一肽鏈4個亞鐵紅素基團實驗操作（一）樣品處理第二十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色②血紅蛋白組成及作用③選材本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。實驗操作（一）樣品處理第二十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一1、紅細胞的洗滌

閱讀課本內(nèi)容，回答以下問題：1、洗滌的目的？

2、怎樣洗滌？

3、洗滌干凈的標志是什么？除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。

采樣分離－吸漿倒紅－加液攪拌－重洗三次

直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。實驗操作（一）樣品處理第二十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果。問：1、洗滌操作過程中，為什么要低速短時間離心？2、為了使紅細胞洗滌干凈，需如何處理？1、紅細胞的洗滌重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。實驗操作（一）樣品處理第二十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一2.血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10min。在蒸餾水和甲苯的作用下，紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。說出：蒸餾水和甲苯的作用。實驗操作（一）樣品處理第二十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一3.分離血紅蛋白溶液問：1、采用什么方法分離血紅蛋白？2、離心分層后，各層的成分各是什么？3、用濾紙過濾，去掉什么成分？實驗操作（一）樣品處理第二十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12h。4.透析問：透析過程及透析目的？透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。實驗操作（一）樣品處理第二十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一4.透析實驗操作（一）樣品處理第二十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一閱讀課本相關內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過程。實驗操作（二）凝膠色譜操作第二十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一實驗操作（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。

②底塞的制作：打孔-挖穴-安管-覆網(wǎng)-紗包-插管

注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第二十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一2.凝膠色譜柱的裝填問:1、凝膠的選擇材料?G代表意義?2、簡單步驟?3、注意點：實驗操作（二）凝膠色譜操作選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍,75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。第三十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一2.凝膠色譜柱的裝填問:1、凝膠的選擇材料?G代表意義?2、簡單步驟?3、注意點：實驗操作（二）凝膠色譜操作步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱第三十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一3.凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙；裝填凝膠柱時不得氣泡存在。（因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。）2.凝膠色譜柱的裝填實驗操作（二）凝膠色譜操作問:1、凝膠的選擇材料?G代表意義?2、簡單步驟?3、注意點：第三十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300mL的20mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12h。問：洗滌平衡的溶液？注意什么？1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果；2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。實驗操作（二）凝膠色譜操作2.凝膠色譜柱的裝填第三十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一3.樣品的加入和洗脫

實驗操作（二）凝膠色譜操作第三十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品吸管吸1mL樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。實驗操作（二）凝膠色譜操作③樣品滲入凝膠床加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。第三十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）。④洗脫小心加入物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液(pH為7.0)到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗