血液分子生物學基因治療

血液分子生物學基因治療第一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一本章內容提示基因治療(genetherapy)體細胞基因治療、生殖細胞基因治療基因轉移方法靶細胞特點、靶細胞種類反義寡核苷酸技術自殺基因與旁觀者效應第二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一基因治療（Genetherapy

）

基因治療（Genetherapy

）：指應用DNA重組技術，將外源正?；驅氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療的目的。為達到這一目的，實施相應的策略。第三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一一、基因治療策略策略：直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療：糾正突變基因

在原位修復缺陷的基因，以達到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)）第四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2、間接療法：以正常的基因替代致病基因。

導入外源正常基因，代替有缺陷的基因,使細胞恢復正常功能而達到治療疾?。ㄓ绕涫沁z傳?。┑哪康?。而對靶細胞而言，沒有去除或修復有缺陷的基因。

第五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一途徑

就基因轉移的受體細胞不同，基因治療有兩種途徑：

1、生殖細胞基因治療

2、體細胞基因治療第六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

1、生殖細胞基因治療將正常基因轉移到患者生殖細胞（精細胞，卵細胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。

第七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一但還存在某些問題：（1）靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質性進展；（2）基因轉移效率不高，只能用顯微注射方法；（3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細胞的辦法。一次可獲取少者3-5個，多者十幾個。）第八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2．體細胞基因治療

somaticcellgenetherapy

將正?；蜣D移到體細胞，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。第九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

措施：（1）正?；蜣D移至體外培養(yǎng)的體細胞，有效表達后，再回輸?shù)襟w內。（2）正?；驅氚屑毎?，定位整合到染色體上，準確的替換異常基因，是理想的措施。（3）隨機整合，非特定座位，只要有效的表達即可達到治療的目的。（4）體細胞基因治療理論上不必矯正所有的體細胞。第十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一存在的問題

對特定座位基因轉移，目前還存在較大困難；隨機插入可能引起后代的基因突變。第十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一二、基因治療的方法基因治療的關鍵性步驟----

目的基因的獲得與轉移

第十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一基因治療首先獲得目的基因，通常從基因組中分離

基因克隆↓定位↓表達↓評價表達情況（一）目的基因的獲得—

正?；虻姆蛛x與克隆第十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（二）外源基因的轉移通過不同方法，將目的基因轉移至受體細胞。第十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（1）物理方法1）電穿孔法（electroporotion）將細胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質中的DNA可滲進細胞，進而表達。

瞬間細胞細胞膜核膜通透性增加

高壓脈沖

DNA滲入細胞第十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細胞

第十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一常用的細胞（1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動物子宮→胚胎→個體。（2）胚胎干細胞：從著床前的動物胚胎中分離多功能胚胎干細胞→基因操作→注射入動物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個體。

第十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一用顯微注射儀將外源基因直接注射入實驗動物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，從而得到轉基因動物。特點：導入速度快，操作步驟不復雜，對DNA大小無限制，不需要載體，整合效率較高，它可以直接獲得純系。缺點：需要貴重精密儀器，技術操作較難，并且外源基因的整合位點和整合的拷貝數(shù)都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改變，重則致死。第十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一例：轉基因動物的制備

重組基因DNA

微注射（體外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

動物模型：轉基因鼠

(每個鼠細胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)第十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一第二十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一clonesheepDolly體細胞提取核重組細胞回植Dolly卵細胞去核細胞第二十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

轉基因動物研究大事記

1974年，美國學者Jaenisch應用顯微鏡注射法把基因導入真核細胞。

1981年，美國科學家將外源基因導入動物胚胎，創(chuàng)立了轉基因動物技術。

1982年獲得轉基因小鼠。

1987年，世界上第一只商業(yè)化轉基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。

第二十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一3）微粒子轟擊法

利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑使微粒瞬間既可進入靶細胞，達到轉移目的基因的目的，而不損傷靶細胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細胞中表達。第二十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（2）化學法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，易通過細胞膜進入細胞內，并整合到受體細胞基因組中，在適當條件下得以表達。第二十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一磷酸鈣+DNA→混合微細顆?！?/p>

沉淀反應20~30min

↓

細胞在沉淀物中暴露5~24h

方法簡單，但轉化效率低。第二十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（3）脂質體法（liposome）應用人工制備的類似細胞膜的膜性結構——脂質體，包裝外源基因，再與靶細胞融合，外源DNA導入靶細胞，使其表達。

DNA細胞融合轉化細胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜第二十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（4）同源重組法

同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。

是將外源基因定位導入細胞的染色體上。

單交換

雙交換

第二十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一通過同源重組定點插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正?；蜃粠в兄榈鞍谆虻馁|粒

C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細胞死亡，將有重組的細胞篩選出來。第二十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（5）病毒介導基因內轉移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術與病毒重組，然后去感染受體細胞感染細胞重組病毒第二十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一病毒載體病毒具有一些獨特的性質如多數(shù)病毒可感染特異的細胞，在細胞內不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因表達水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉運載體；目前已被用作載體的病毒有逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和肝炎病毒等。第三十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

病毒的分類（1995年）*DNA病毒*RNA病毒*逆轉錄病毒病毒的增殖（復制）*吸附與穿入：細胞膜表面的特異性受體。*脫殼：溶菌酶作用下，病毒體釋放出基因組核酸。*生物合成：病毒核酸的復制及蛋白質的合成。*轉配與釋放：復制出子代病毒的核酸與蛋白質，在細胞內裝配為成熟的病毒體；并從宿主細胞釋放。

第三十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

逆轉錄病毒(RNA)

常用的病毒載體

DNA病毒

1)逆轉錄病毒（retrovirus）

目前應用最多、最成功.病毒感染細胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。第三十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結構：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增強子，R=啟動子，U5=轉錄起始位點。

Ψ=病毒包裝信號，gag=核心抗原，pol=逆轉錄酶，env=外殼蛋白。第三十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

逆轉錄病毒載體構建的技術路線

*

gag,pol,env序列去除，保留LTR和Ψ，使逆轉錄病毒成為無復制能力的缺陷病毒。

*在gag,pol,env序列去除的區(qū)域，插入目的基因序列和報告基因序列（如GFP)。

*將目的基因、其兩端的LTR以及Ψ這一序列插入經(jīng)改造的質粒內。

*將gag-pol序列插入經(jīng)改造的質粒

*將env序列插入經(jīng)改造的質粒第三十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一質粒

*

是位于細菌內的雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。

*他們又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質來進行復制和轉錄。

*質粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復雜有機化合物等。第三十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

ori5’LTR

Ψ目的基因

標記基因3’LTR抗生素基因第三十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一第三十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一逆轉錄病毒載體優(yōu)點：①高效感染宿主細胞，轉染率可達100%②病毒基因和所載的外源基因都可能表達③宿主范圍廣，可同時感染大量細胞并長期存留第三十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一缺點

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒隨機插入靶細胞基因組中，因病毒具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的基因過度表達或失活，插入的外源基因可能不適當?shù)谋磉_；第三十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一③逆轉錄病毒有致癌作用，可能使受體細胞癌變。

根據(jù)逆轉錄病毒的缺點，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號。第四十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（6）受體載體轉移法將含有目的基因的重組質粒和某些細胞表面受體能識別的特異性多肽（配體）形成復合物，通過細胞內吞途徑達到轉移基因的目的。重組質粒配體細胞膜復合物第四十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（三）靶細胞的選擇靶細胞是指接受外源Gene的體細胞選擇靶細胞的原則是：1）便于體外培養(yǎng)和進行遺傳技術操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內；3）具有增殖優(yōu)勢，生命周期長（能存活幾月至幾年，或整個生命周期）；4）易于受外源遺傳物質轉化。第四十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一常見的靶細胞外周血T淋巴細胞上皮細胞內皮皮膚成纖維細胞造血干細胞——β地中海貧血、嚴重復合免疫缺陷病等基因治療肝細胞——家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的基因治療肌細胞第四十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一三、基因治療的現(xiàn)狀與前景體細胞基因治療臨床實驗已經(jīng)開始，生殖細胞基因治療正在完善。進行基因治療必須具備下列條件：第四十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一具備下列條件選擇適當?shù)募膊。宄膊〉陌l(fā)病機理，基因的結構和功能。目的基因已克隆，并清楚基因表達與調控機制與條件。選擇適當?shù)氖荏w細胞并在體外有效表達。安全有效的基因轉移方法，以及供利用的動物模型。第四十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一基因治療實例1、復合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。第四十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一ADA-Gene+vector（逆轉錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導入細胞生長分裂

10天

Gene表達

回輸患兒體內

1~2月治療一次,10個月患兒體內ADA水平達正常人的25%

第四十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時間長，輕傷、小手術后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學者薛京倫實施的FⅨ的基因治療。第四十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一逆轉錄病毒載體

+FⅨcDNA

重組體

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①導入倉鼠細胞（CHO）→FⅨ表達；②導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達；③91年，導入乙型血友病患者皮膚成纖維細胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達，F(xiàn)Ⅸ基表達水平達正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。第四十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一3、黑色素瘤的基因治療腫瘤基因治療是人們十分關注的問題，進行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點協(xié)助治療腫瘤。第五十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一例：細胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉錄病毒載體導入

TIL（體外培養(yǎng)的自體細胞）回植患者體內

TIL進入自體腫瘤部位，提高細胞因子殺傷腫瘤細胞的作用。第五十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一4、自殺基因的基因治療X

原理：即用（逆轉錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉染到腫瘤細胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉變?yōu)榧毎緩秃衔?，進而殺傷腫瘤細胞（腫瘤細胞不能復制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達，而正常細胞中不表達。第五十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

自殺基因(suicidegene)是一類前體藥物轉換酶基因，其編碼的特異性酶類將原先對細胞無毒或毒性極低的前體藥物在腫瘤細胞內代謝成毒性產(chǎn)物，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。目前研究過的自殺基因有十余種，最常用的是HSV-TK/GCV和CD/5-FC兩種自殺基因系統(tǒng)。4、自殺基因的基因治療第五十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一如：自殺基因+病毒載體

轉染重組載體

藥物前體無毒Gene→酶→↓

藥物復合物有毒

細胞死亡第五十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一例如：

單純皰疹病毒

哺乳動物細胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細胞中表達，正常細胞中不表達）Gene—TKGCV（胸苷類似物）