生物合成青蒿酸課件

1簡介1.瘧疾是一種由瘧原蟲造成的，通過瘧蚊傳播的全球性急性寄生蟲傳染病2.瘧原蟲惡性瘧原蟲具有復(fù)雜的生命周期，因而很難根除這種疾病，治療是唯一的選擇。而抗藥瘧原蟲突變系的出現(xiàn)更嚴(yán)重阻礙了對這種疾病的控制。

據(jù)WTO統(tǒng)計，2010年有2億瘧疾病例，并導(dǎo)致655000人死亡。3.青蒿素一種由我國學(xué)者在20世紀(jì)70年代初從ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗稱青蒿）中提煉出來的倍半萜內(nèi)酯環(huán)內(nèi)過氧化物（C-15倍半萜），通過釋放高劑量的自由基殺死隱藏于紅細胞中的惡性瘧原蟲。是目前世界上最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的藥物，被世界衛(wèi)生組織稱為“治療瘧疾的最大希望”。2簡介4.青蒿素工藝路徑人工全化學(xué)合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而不能投入生產(chǎn)。世界上青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠我國從野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%

w/w),且受地域性種植影響較大。用酵母生產(chǎn)青蒿酸，再由青蒿酸合成青蒿素本文使用了半化學(xué)合成法來生產(chǎn)青蒿素。

研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過以下途徑在青蒿細胞內(nèi)合成的：焦磷酸法呢酯（FPP）Amorphadiene（合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前體原料）青蒿酸青蒿素青蒿素天然合成路徑由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP到Amorphadiene再到青蒿酸這兩個過程克隆進入酵母細胞內(nèi)，并對細胞內(nèi)的其他與之相關(guān)的基因進行調(diào)控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

4酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合成鯊烯，最終獲得固醇CYP71AV1：控制一種細胞色素P450合成的酶CPR1：與CYP71AV1對應(yīng)的還原酶的表達基因5主要工作開發(fā)了一種利用純態(tài)氧（singletoxygen）將青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素的有效、可行的化學(xué)合成途徑2本文證實了青蒿酸在酵母體內(nèi)全生物合成途徑，并發(fā)現(xiàn)了一種植物脫氫酶和另一種細胞色素（CYB5）

16酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合成鯊烯，最終獲得固醇CYP71AV1：控制一種細胞色素P450合成的酶CPR1：與CYP71AV1對應(yīng)的還原酶的表達基因7Amorphadiene

合成青蒿酸途徑1.已有文獻指出細胞色素b5與細胞色素P450酶作用會增強細胞色素P450酶的反應(yīng)速率。本文鑒定出一種細胞色素b5的cDNA,從而獲得編碼細胞色素b5的基因CYB5。2.近期分離出了青蒿醛脫氫酶的cDNA,并將其對應(yīng)的基因ALDH1在酵母體內(nèi)表達3.檢測到一種脫氫酶，對其純化分析，并通過ESTs、序列分析等獲得基因ADH1綜上，我們認(rèn)為有5種酶（CYP71AV1、CPR1、CYB1、ADH1和ALDH1）參與了amorphadiene氧化為青蒿酸的過程，并將其重新在酵母中構(gòu)建形成生物合成amorphadiene的完整路徑。8生物合成青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-ERG9）Y1516（PCTR3-ERG9）將控制ERG9基因表達的啟動子PMET3替換為PCTR3Y285（PMET3-ERG9）導(dǎo)入表達CYP71AV1和CPR1基因的高拷貝質(zhì)粒Y301（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入表達CYP71AV1和CPR1基因的高拷貝質(zhì)粒將控制ERG9基因表達的啟動子PMET3替換為PCTR39

結(jié)果Y337產(chǎn)amorphadiene12g/LY285產(chǎn)青蒿酸3.3g/L+amorphadiene0.3g/L+青蒿酸乙酯0.18g/L（不產(chǎn)青蒿醛）Y285產(chǎn)量少，且生長能力顯著變差，猜測是由細胞色素P450氧化amorphadiene，或青蒿酸的積累引起的10生物合成青蒿酸菌株改造：Y657（PCTR3-ERG9）插入弱啟動子GAL3控制CPR1的表達，并將其整合到基因組DNA上Y692（PCTR3-ERG9）將受強啟動子GAL7控制的CYB5基因整合到染色體導(dǎo)入ALDH1基因Y1368（PCTR3-ERG9）Y1283（PCTR3-ERG9）Y1284（PCTR3-ERG9）敲除GAL80基因Y301（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入ALDH1基因Y973（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入ADH1基因11

結(jié)果Y657較Y285（或Y301，是將Y285啟動子PMET3替換為PCTR3

）細胞生長能力增強，但青蒿酸產(chǎn)量降低盡管降低CPR1的表達水平降低了青蒿酸的產(chǎn)量，總的倍半萜烯類物質(zhì)產(chǎn)量仍很高，說明低CPR1表達量增加細胞的生存能力，但減少了amorphadiene氧化物的生成速率12

結(jié)果對比Y657和Y692，發(fā)現(xiàn)Y692的青蒿素、青蒿醛的產(chǎn)量均較高，總倍半萜烯類產(chǎn)物的產(chǎn)量增加了40%，說明CYB5基因的表達會提高青蒿素產(chǎn)率對比Y692和Y1368,說明ALDH1基因的表達顯著地增加了青蒿酸的產(chǎn)量，并且檢測不到產(chǎn)物青蒿醛，且菌株的生存能力顯著增加，產(chǎn)量是菌株Y285的兩倍多。對比Y1368和Y1283，青蒿酸產(chǎn)量增加了18%，說明ADH1基因的表達能增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量13添加IMP表達ALDH1基因的菌株以胞外晶體沉淀的形式生產(chǎn)青蒿酸，沉淀在初期發(fā)酵時便能觀察到，這對使得多相發(fā)酵樣品中產(chǎn)品的精確測量變得復(fù)雜。為了克服由青蒿酸結(jié)晶沉淀帶來的困難，我們利用萃取發(fā)酵溶解沉淀的現(xiàn)象，在十四酸異丙酯（IMP)環(huán)境中培養(yǎng)菌體。14

結(jié)果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力顯著加強15

結(jié)果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力顯著加強。同時，對Y285、Y301、Y657和Y692菌株（缺乏ALDH1和ADH1基因）而言，添加IPM會導(dǎo)致中間產(chǎn)物的析出。而對有ALDH1和ADH1基因的菌株，添加IPM會提高青蒿酸的產(chǎn)量16

化學(xué)途徑1.thereductionoftheD11(13)doublebond.2.theesterificationofthecarboxylicacid.3.an‘ene-type’reactionoftheC4–C5doublebondwi