血紅蛋白的提取和分離試用課件

2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進入了后基因組和蛋白質(zhì)組時代人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究1醫(yī)學(xué)ppt2醫(yī)學(xué)ppt(一）蛋白質(zhì)占細胞干重的50％以上，細胞中含量最多的有機物2、組成元素C、H、O、N一、基礎(chǔ)知識1、含量3、相對分子質(zhì)量高分子化合物3醫(yī)學(xué)ppt4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸連接方式脫水縮合4醫(yī)學(xué)ppt8、分子結(jié)構(gòu)7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（一條或者多條）5醫(yī)學(xué)ppt10、生理功能細胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動的主要承擔(dān)者氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性6醫(yī)學(xué)ppt1、分離生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子2、蛋白質(zhì)分離和提取的原理根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)(二）蛋白質(zhì)的提取7醫(yī)學(xué)ppt（三）分離蛋白質(zhì)的方法②實例：葡聚糖、瓊脂糖（2）凝膠1、凝膠色譜法（別名分配色譜法）①性質(zhì)：一些微小多孔的球體，內(nèi)含許多貫穿的通道（1）概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離8醫(yī)學(xué)ppt①大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道（3）凝膠色譜法的原理—分子篩效應(yīng)③分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離②當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢9醫(yī)學(xué)ppt（5）具體過程蛋白質(zhì)分子量的大小（4）依據(jù)的特性10醫(yī)學(xué)ppt11醫(yī)學(xué)ppt12醫(yī)學(xué)ppt（四）緩沖溶液1、概念在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的PH值的影響，維持PH基本不變2、作用13醫(yī)學(xué)ppt4、緩沖溶液的組分分類①弱酸和弱酸鹽組合H2CO3NaHCO3

CH3COOHCH3COONa3、緩沖溶液的配制通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液14醫(yī)學(xué)ppt②弱堿和弱堿鹽NH4OHNH4CL③多元弱酸的酸式鹽和其他所對應(yīng)的次級鹽NaH2PO4Na2HPO4KH2PO4K2HPO4如何證明色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？15醫(yī)學(xué)ppt

（五）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。16醫(yī)學(xué)ppt3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。17醫(yī)學(xué)ppt

聚丙烯酰胺凝膠電泳1、在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)18醫(yī)學(xué)ppt蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素2、原理3、SDS作用為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入SDS19醫(yī)學(xué)pptSDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小4、SDS作用機理20醫(yī)學(xué)ppt討論：如何測定蛋白質(zhì)的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售.21醫(yī)學(xué)ppt二、實驗操作樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定1、樣品處理（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟(1)血液組成（二）操作過程22醫(yī)學(xué)ppt血液血漿水分固體物質(zhì)血漿蛋白無機鹽磷脂葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團①成分23醫(yī)學(xué)ppt血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：24醫(yī)學(xué)ppt

用雞的紅細胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提?。蝗说募t細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。25醫(yī)學(xué)ppt(2)紅細胞的洗滌①洗滌紅細胞目的除去其中的雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少②洗滌操作A、采集血樣B、低速短時間離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果）26醫(yī)學(xué)pptC、吸取血漿：上層透明的黃色血漿D、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌E、低速離心（低速短時間）F、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈27醫(yī)學(xué)ppt初次離心后的結(jié)果28醫(yī)學(xué)ppt3次洗滌后的結(jié)果29醫(yī)學(xué)ppt(3)血紅蛋白的釋放加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白(4)分離血紅蛋白溶液①過程將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min30醫(yī)學(xué)ppt第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）②試管中溶液層次31醫(yī)學(xué)ppt用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體③分離32醫(yī)學(xué)ppt取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(5)透析除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)①過程②透析目的33醫(yī)學(xué)ppt34醫(yī)學(xué)ppt利用透析袋透析35醫(yī)學(xué)ppt2、凝膠色譜（1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端36醫(yī)學(xué)ppt底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底注意事項：⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)③頂塞的制作打孔安裝玻璃管④組裝將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體37醫(yī)學(xué)ppt38醫(yī)學(xué)ppt（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇A、材料“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克B、代表意義：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）39醫(yī)學(xué)ppt配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法A、固定B、裝填將色譜柱處置固定在支架上將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻40醫(yī)學(xué)ppt注意：2、裝填凝膠柱時不得氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙41醫(yī)學(xué)ppt42醫(yī)學(xué)ppt1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果

注意：2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時④洗滌平衡43醫(yī)學(xué)ppt（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面②滴加透析樣品吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關(guān)閉出口44醫(yī)學(xué)ppt45醫(yī)學(xué)ppt③樣品滲入凝膠床④洗脫加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口小心加入pH為7的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）46醫(yī)學(xué)ppt開始進行層析47醫(yī)學(xué)ppt收集得到的純化后的蛋白48醫(yī)學(xué)ppt討論：答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能⑥注意：正確的加樣操作1、不要觸及破壞凝膠面2、貼壁加樣3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？49醫(yī)學(xué)ppt2、與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。50醫(yī)學(xué)ppt思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)51醫(yī)學(xué)ppt血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？52醫(yī)學(xué)ppt觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實驗結(jié)果分析與評價1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？53醫(yī)學(xué)ppt由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？54醫(yī)學(xué)ppt如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？55醫(yī)學(xué)ppt1.紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。注意事項56醫(yī)學(xué)ppt 教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的