血流感染實(shí)驗(yàn)室診斷演示文稿

血流感染實(shí)驗(yàn)室診斷演示文稿當(dāng)前第1頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)優(yōu)選血流感染實(shí)驗(yàn)室診斷當(dāng)前第2頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)內(nèi)容什么是血流感染？血流感染流行病學(xué)特點(diǎn)血培養(yǎng)流程優(yōu)化提高陽性率分析培養(yǎng)結(jié)果減少污染分子生物學(xué)方法檢測(cè)血流感染基于PCR的技術(shù)MALDI-TOFMSPNA-FISH當(dāng)前第3頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)概念感染＝炎癥+病原體全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）體溫>38?C或<36?C心率>90次/分呼吸頻率>20次/分，或PaCO2<32mmHg白細(xì)胞>12×109/L或<4×109/L，或幼稚細(xì)胞>10%膿毒血癥（sepsis）＝感染+SIRS，血培養(yǎng)可以陽性或陰性重度膿毒血癥（severesepsis）＝sepsis+臟器功能障礙、組織灌注不良和低血壓感染性休克（septicshock）當(dāng)前第4頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)概念敗血癥（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合征，是一種嚴(yán)重的全身感染。病原菌主要是細(xì)菌，也可為真菌、分枝桿菌等。菌血癥（bacteremia）：細(xì)菌在血流中短暫出現(xiàn)的現(xiàn)象，一般無明顯毒血癥狀，在國(guó)外文獻(xiàn)中常與敗血癥通用。血流感染（bloodstreaminfection,BSI）：敗血癥和菌血癥目前統(tǒng)稱為血流感染。當(dāng)前第5頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血流感染醫(yī)院獲得性血流感染原發(fā)血流感染實(shí)驗(yàn)室證實(shí)血流感染（Laboratory-confirmedBloodstreamInfection,LCBI）臨床血流感染（ClinicalSepsis）繼發(fā)血流感染：血培養(yǎng)分離出有意義微生物，而且此微生物與另一部位之院內(nèi)感染有關(guān)。唯不包括血管或血管內(nèi)導(dǎo)管裝置所引起之血流感染。社區(qū)獲得性血流感染當(dāng)前第6頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)血流感染（LCBI）標(biāo)準(zhǔn)一：從一次或多次血標(biāo)本中培養(yǎng)出一種一致的致病菌，而且培養(yǎng)出的病原體與其它部位的感染無關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)二：病人至少具有下列癥狀和體征之一：發(fā)熱（>38?C），寒顫或低血壓，并致病符合下列之一：1.從兩次或兩次以上不同部位抽血的標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌（如類白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌）。2.至少一次從帶血管內(nèi)導(dǎo)管的病人血標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌群（如類白喉?xiàng)U菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌），并且主管醫(yī)生開始了適當(dāng)?shù)目咕幬镏委煛?.血中抗原檢測(cè)陽性（如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌或B群鏈球菌）。與實(shí)驗(yàn)室陽性結(jié)果一致的癥狀和體征與其它部位的感染無關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)三：年齡<1歲的病人具備下列癥狀或體征中的至少一項(xiàng)，發(fā)熱（>38?C），低溫（<37?C），呼吸暫停、脈搏徐緩，并具有下列之一（同上3點(diǎn)略）當(dāng)前第7頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)臨床血流感染（ClinicalSepsis）具有下列二條件之一者：具有非其它已知原因所引起的發(fā)燒、血壓過低（收縮壓≤90mmHg或收縮壓低于平常超過40mmHg），少尿（每小時(shí)尿量低于30ml）等臨床癥狀任何一項(xiàng)，且符合下列所有條件者：未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者其它部位無明顯感染者醫(yī)生針對(duì)此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治療1歲以下嬰兒，具有非其它書籍原因引起的發(fā)燒、體溫過低、呼吸中止或心跳過緩等臨床癥狀任何一項(xiàng)，且符合下列所有條件者：未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者其它部位無明顯感染者醫(yī)生針對(duì)此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治療當(dāng)前第8頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)BSI流行病學(xué)特點(diǎn)BSI發(fā)病率逐年增加凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、真菌血流感染發(fā)病率逐年上升，革蘭陰性菌下降耐藥菌比例逐年增加社區(qū)獲得與醫(yī)院獲得血流感染病原譜存在差異院內(nèi)BSI患者病死率高當(dāng)前第9頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)美國(guó)膿毒血癥流行病學(xué)+600%+300%+300%Martinetal,NEJM2003;348:1546當(dāng)前第10頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)加拿大CANWORD監(jiān)測(cè)2002-2009DiagMicrobioloInfectDis.2011;69:307當(dāng)前第11頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)加拿大CANWORD監(jiān)測(cè)2002-2009DiagMicrobioloInfectDis.2011;69:307當(dāng)前第12頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)美國(guó)49醫(yī)院BSI病原譜CID.2004,39:309-317當(dāng)前第13頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PUMCH2012年834血培養(yǎng)分離株當(dāng)前第14頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PUMCH2012年144株BSI大腸埃希菌藥敏結(jié)果ESBL60.2%當(dāng)前第15頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果ESBL34.4%當(dāng)前第16頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PUMCH2012年61株BSI鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果當(dāng)前第17頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PUMCH2012年76株BSI金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果當(dāng)前第18頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PUMCH2012年46株BSI草綠色溶血鏈球菌藥敏結(jié)果當(dāng)前第19頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)2011CHIF-NET489株BSI酵母菌當(dāng)前第20頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)2011CHIF-NET念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性當(dāng)前第21頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)2011CHIF-NET念珠菌對(duì)伏立康唑的敏感性當(dāng)前第22頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)2011CHIF-NET其他酵母菌對(duì)氟康唑的敏感性當(dāng)前第23頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)2011CHIF-NET其他酵母菌對(duì)伏立康唑的敏感性當(dāng)前第24頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)采血量是影響血培養(yǎng)陽性率的

獨(dú)立相關(guān)因素CLSIM47-A：每位患者采集2~3套血培養(yǎng)（40~60ml）SurvivingSepsisCampaignGuidelines(Worldwide)：抗菌藥物治療前至少采集2套血培養(yǎng)英國(guó)NHS血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)：采集2套血培養(yǎng)當(dāng)前第25頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)采血量對(duì)血培養(yǎng)陽性率的影響JCM2007當(dāng)前第26頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)采血量對(duì)血培養(yǎng)陽性率的影響J.Clin.Microbiol.2011,49(12):4047當(dāng)前第27頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)J.Clin.Microbiol.2011,49(12):4047

RoutineSet@MayoClinic:2BACTECAerobicPlusBottles+1BACTECAnaerobicLyticBottle采血量和陽性率28非條件致病菌當(dāng)前第28頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)29在多次血培養(yǎng)中單次培養(yǎng)下列細(xì)菌陽性凝固酶陰性葡萄球菌棒狀桿菌微球菌丙酸桿菌芽孢桿菌如多次培養(yǎng)陽性，可能為條件致病菌，需結(jié)合臨床分析血培養(yǎng)污染菌當(dāng)前第29頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)非條件致病菌MayoClinic(p<0.001)為什么需氧+厭氧？30PathogenNo.兩種組合均能檢測(cè)不同的病原菌J.Clin.Microbiol.2011,49(12):4047當(dāng)前第30頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)表皮葡萄球菌血培養(yǎng)陽性意義CID1997當(dāng)前第31頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)陽性時(shí)間－凝固酶陰性葡萄球菌96%(+)86%單瓶（＋）需氧瓶＝242厭氧瓶＝72需＋厭＝150當(dāng)前第32頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)陽性時(shí)間－金黃色葡萄球菌當(dāng)前第33頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)如何分析血培養(yǎng)凝固酶陰性葡萄球菌？UniversityHospitalofBase，2003－20073060陽性血培養(yǎng)，654CNS，粒缺患者除外232(35%)真正BSI，422(65%)污染BSI由感染科醫(yī)生判斷，至少一份血培養(yǎng)CNS陽性，有感染臨床表現(xiàn)SIRS:體溫>38Cor<36C;心率>90/min;呼吸>20/min;白細(xì)胞>12or<4G/Lor>10%未成熟中性粒細(xì)胞32%患者有1瓶以上CNS陽性，BSI68%，污染12%

(p<0.001)沒有SIRS癥狀：BSI5%，污染29%

(p<0.001)ClinMicrobiolInfect.2012online當(dāng)前第34頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)單瓶血培養(yǎng)CNS的BSI和污染患者區(qū)別ClinMicrobiolInfect.2012online當(dāng)前第35頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)單瓶血培養(yǎng)CNS陽性BSI與臨床癥狀相關(guān)性ClinMicrobiolInfect.2012online當(dāng)前第36頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)ClinMicrobiolInfect.2012online當(dāng)前第37頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)降低血培養(yǎng)污染率－－嚴(yán)格消毒血培養(yǎng)瓶消毒：70%酒精消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞,待干60秒。或70%異丙醇消毒干燥皮膚消毒：三步法70%酒精擦拭靜脈穿刺點(diǎn)>30秒1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：從穿刺點(diǎn)向外畫圈消毒,直徑>3cm70%酒精脫碘一步法葡萄糖酸洗必泰作用30s，或70%異丙醇消毒后自然干燥，但不適用于2個(gè)月以內(nèi)的新生兒。當(dāng)前第38頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)急診血培養(yǎng)污染率與工作量相關(guān)TheUniversityofMichiganHealthSystem急診血培養(yǎng)大多數(shù)由采血員采集，其次為護(hù)士和醫(yī)生采血員:病人=1:9，重癥區(qū)護(hù)士:病人=2:3，其它區(qū)域護(hù)士:病人=1:4年病人量82521人，采集血培養(yǎng)者7586人11.4%至少1瓶陽性，病原菌陽性率8.0%，污染率3.7%多套培養(yǎng)患者陽性率7.4%，單套培養(yǎng)陽性率5.1%（p<0.001），污染率無顯著差別（2.2%vs.2.6%）SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online當(dāng)前第39頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)急診小時(shí)工作量SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online當(dāng)前第40頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)繁忙時(shí)血培養(yǎng)污染率增加OR=1.23OR=0.93SchuylerHalverson,etal.JCM.2013online當(dāng)前第41頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)抗菌藥物治療與血流感染死亡率死亡率Chest115(2):1999當(dāng)前第42頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)三級(jí)報(bào)告制度血培養(yǎng)陽性終報(bào)告革蘭染色傳種培養(yǎng)初步報(bào)告(直接藥敏)鑒定菌株電話報(bào)告鑒定＋標(biāo)準(zhǔn)藥敏43當(dāng)前第43頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)對(duì)治療的影響A=AppropriateTherapy(正確治療)I=InappropriateTherapy(不正確治療)ClinInfecDis24:584-602,1997當(dāng)前第44頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血流感染快速分子診斷分子診斷不受抗菌藥物使用的影響血培養(yǎng)陽性后分子診斷直接使用血標(biāo)本進(jìn)行分子診斷快速但不能提供藥敏結(jié)果當(dāng)前第45頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)陽性瓶分子鑒定AntigoneKotsaki,etal.ExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209當(dāng)前第46頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測(cè)PCR特異性檢測(cè)病原特異性PCR特定耐藥基因檢測(cè)：葡萄球菌mecA,腸球菌van細(xì)菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數(shù)廣譜檢測(cè)：PCR擴(kuò)增特定靶位多態(tài)性分析測(cè)序后續(xù)基因檢測(cè)種特異性real-timePCRExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.CurrOpinInfectDis.

2011,24(2):137當(dāng)前第47頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌Target：ecfXgene血培養(yǎng)系統(tǒng)：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均顯示G-b對(duì)照方法：氧化酶，API20EDNA提?。?.5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法定量PCR：擴(kuò)增：Oligonucleotideprimers基因特異性檢測(cè)：fluorescent-labeledhybridizationprobes，152bpfragmentAnnalClinMicrobiolAntimicrob2010,9:2148當(dāng)前第48頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌33瓶pae，敏感性和特異性均為100%1瓶kpn+pae，由于pae

(20CFU/ml)≤kpn(108CFU/ml)，PCR(-)檢測(cè)限：將ATCC27853ecfX基因克隆至TOP10E.coliAnnalClinMicrobiolAntimicrob2010,9:2149當(dāng)前第49頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)陽性血培養(yǎng)－基于PCR的檢測(cè)最常見病原體多重PCR電泳譜、ELISA雜交、多重Real-timePCRHyplexBloodScreen(BAG,Lich,Germany):多重PCR+ELISA,4.5-6h完成Prove-ItSepsis(Mobidiag,Helsinki,Finland)：多重real-timePCR+微陣列分析，檢測(cè)多種病原及mecA，3h完成多重Real-timePCRExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.當(dāng)前第50頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)陽性－多重real-timePCRNEWMICROBIOLOGICA,36,65-74,2013當(dāng)前第51頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)陽性－多重real-timePCRNEWMICROBIOLOGICA,36,65-74,2013當(dāng)前第52頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血培養(yǎng)陽性－PNAFISH

核酸熒光原位雜交血培養(yǎng)陽性肉湯革蘭染色PNAFISH革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌報(bào)道Salmonellaspp.90minPNAFISH完成ApplEnvironMicrobiol.2010;76:4476

J.Clin.Microbiol.2013,51(4):1301JClinMicrobiol.2009;47:24753當(dāng)前第53頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)MALDI-TOFMS基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中形成結(jié)晶后直接進(jìn)樣，當(dāng)用激光照射結(jié)晶時(shí)，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量，使基質(zhì)分子和樣品獲得能量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子。基質(zhì)在樣品離子形成過程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品帶上正電荷或負(fù)電荷，成為帶電荷的離子基質(zhì)會(huì)干擾被檢測(cè)分子質(zhì)譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基質(zhì)當(dāng)前第54頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)MALDI-TOFMS飛行時(shí)間（TOF）原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場(chǎng)獲得動(dòng)能，當(dāng)進(jìn)入高真空無電場(chǎng)飛行管道并在此管道內(nèi)飛行時(shí)，質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，早到達(dá)檢測(cè)器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，晚到達(dá)檢測(cè)器。因此依據(jù)離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比平方根（m/z）成正比的關(guān)系，通過測(cè)定飛行時(shí)間，計(jì)算出相應(yīng)離子的分子量。當(dāng)前第55頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)MALDI-TOFMS操作步驟當(dāng)前第56頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)MALDI-TOFMS快速鑒定陽性血培養(yǎng)使用菌落、陽性血培養(yǎng)肉湯鑒定快速：20分鐘(從報(bào)警到鑒定出結(jié)果）MALDI-TOFMS(Bruker)+BACTEC(BD):正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽性菌(89.02%)80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出一種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnMALDI-TOFMS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):388個(gè)陽性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌）15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫(kù)多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽性庫(kù)分析，6瓶鑒定出第二種菌ClinMicrobiolInfect2010;16:1631

JClinMicrobiol2010;48:154257當(dāng)前第57頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)MALDI-TOFMSVITEKMS(bioMérieux)以16s為金標(biāo)準(zhǔn)，980株臨床分離株，ID正確率腸桿菌科97.7%非發(fā)酵菌92%葡萄球菌屬94.3%鏈球菌屬84.8%HACEK84%酵母菌85.2%58J

ClinMicrobiol.2010;48:900當(dāng)前第58頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)PCR/ESIMS廣譜PCR－ESIMS（電噴射質(zhì)譜）189陽性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，種一致率98.7%6例spn標(biāo)本方法陰性提供定量結(jié)果－－評(píng)估病原體載量假陰性率24%：幾乎均由混合感染導(dǎo)致5-6h完成檢測(cè)結(jié)合PCR的敏感性和ESIMS特異性可以直接檢測(cè)標(biāo)本，不需要培養(yǎng)ProcNatlAcadSci.2005;102:8012當(dāng)前第59頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)血標(biāo)本分子檢測(cè)種特異性、屬特異性、廣譜、多重PCR、微陣列分析血培養(yǎng)陰性的苛養(yǎng)菌，如Bartonellaspp.巴爾通體,Coxiellaburnetii伯氏考克斯體,Mycoplasmaspp.支原體,Chlamydiaspp.衣原體,Ricketssiaspp.立克次體，Tropherymawhipplei當(dāng)前第60頁\共有69頁\編于星期四\12點(diǎn)商品化分子生物學(xué)檢測(cè)方法:血標(biāo)本SeptiFast?(Roche)：multiplexreal-timePCR，種屬特異性熒光探針，檢測(cè)重要血流感染致病菌SepsiTestTM?(Molzym)：eubacterialandpanfungalreal-timePCR，a16Sand18SrRNA

gene-baseduniversalPCR+sequencing，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌VYOO?(SIRSLab)：multiplexPCR，檢測(cè)重要血流感染菌，電泳分離擴(kuò)增片段Plex-ID?(Abbott)：eubac