柱層析培訓(xùn)方案

柱層析培訓(xùn)

Sundia

XieLihua2012柱層析的原理硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般悄況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。主要步驟一、估算和稱量硅膠。二、選柱子，三、裝柱四、上樣。五、過柱和收集。六、檢測。七、樣品最后處理。一、估算和稱量硅膠。

200一300目硅膠，稱15一30倍上樣量；這個(gè)比例不是絕對的，如果是很好分的樣品，比例可以更低，如果是很難分的樣品，比例還可以更高，如果極難分，也可以用50倍量硅膠H。但超出50就沒有太大意義了。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。二、選柱子。

柱子的大小是根據(jù)硅膠的用量決定的，硅膠的用量又是由樣品的性質(zhì)和數(shù)量決定的，其次就是柱子應(yīng)該裝多高，通常柱子的高度是根據(jù)它的直徑來決定的，大約柱高：柱直徑的比例是1:6—1:10，這個(gè)比例也不是絕對的，好分的樣品可以用短粗的柱子，高/徑比例就低，難分的要用細(xì)長的柱子，高/徑比例就高些，但也不是越高越好，太高了，過柱時(shí)間太長，無序擴(kuò)散厲害，反而分離效率低。有了以上的兩條，基本上就可以算出來要選用什么尺寸的柱子了三、裝柱。有干法裝柱和濕法裝柱兩種

真空干法裝柱：在色譜柱下端接上真空，把干的硅膠一次性直接倒入干凈的色譜柱，輕輕拍打柱身使柱子結(jié)實(shí)、上端面平齊，然后再加裝石英砂。再小心加注過柱起始洗脫配比的溶劑。這時(shí)候溶劑會(huì)被真空快速吸到柱子下端，此時(shí)一定要保持真空不能松懈，否則功虧一簣。直到有溶劑流出后，就可以關(guān)閉柱子的下閥門，再拔掉柱子下的真空，讓柱子內(nèi)部的壓力自動(dòng)平衡。注意溶劑液面，千萬別讓柱子干掉。平衡后，壓掉多余的溶劑（液面壓到與石英砂平齊），就算裝好了。三、裝柱。有干法裝柱和濕法裝柱兩種

濕法裝柱：先要把干硅膠攪成勻漿，具體做法是加入干硅膠體積一到兩倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁绻疵搫┦鞘兔眩宜嵋阴ィw系，就用石油醚：如果洗脫劑是氯仿／醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑太少或者其中含水量太大，尤其是用乙酸乙酯／丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。然后如果是小柱子裝上蓄液球，打開柱下活塞，保持柱子通暢，把硅膠與低極性溶劑混合的懸濁液（硅膠溶劑比約1:1~2）倒入柱子將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。然后輕輕敲打柱身使混入的氣泡自然排出。然后隨著沉降，會(huì)有些硅膠沾在蓄液球內(nèi)．最后用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。如果柱子比較大，敲打柱身一般是排不出氣泡的，還需要用干凈的攪棒，輕輕朝一個(gè)方向慢慢攪動(dòng)，以利于氣泡的排出。如此反復(fù)幾次，再用裝柱溶劑把柱子壓實(shí)（約2倍柱體積溶劑），在保持10cm以上的溶劑高度下，慢慢加入石英砂，再把液面壓到與石英砂平齊，柱子就裝好了。注意懸濁液既不能太稠也不能太稀，太稠會(huì)影響流動(dòng)性，氣泡不容易趕出，導(dǎo)致柱身有空洞，太稀了太花時(shí)間，影響工作效率。三、裝柱。有干法裝柱和濕法裝柱兩種

干法和濕法裝柱的共同注意事項(xiàng)及優(yōu)缺點(diǎn)比較：鑒于硅膠是弱酸性的，如果過柱樣品對酸敏感或者本身是堿性的，一般在裝柱溶劑中添加2-5%的三乙胺，可以改善敏感和拖尾。如果是加壓，一定記住先泄壓，再關(guān)柱子的閥門，否則柱填料可能會(huì)被頂空，如果是真空負(fù)壓，則一定是先關(guān)閥門，然后再泄真空，否則也是會(huì)被頂空?？偠灾?，時(shí)時(shí)刻刻都要保持柱子的下端壓力一定不能超過上端。干法優(yōu)缺點(diǎn)：這種方法的好處是速度快，柱子裝的非常緊密，柱效相對較高。不好的地方是，操作較苛刻，柱子的下閥門一定不能漏。有時(shí)候柱子過于密實(shí)，影響洗脫流速。濕法優(yōu)缺點(diǎn)：操作相對簡便，但費(fèi)時(shí)費(fèi)事費(fèi)溶劑，硅膠容易揚(yáng)塵。四、上樣。有干法上樣和濕法上樣兩種干法上樣：就是把樣品溶解后加入粗硅膠，然后除去溶劑，先把樣品制砂。要點(diǎn)有以下幾點(diǎn)，樣品一定要全溶，不能用細(xì)硅膠，制砂一定要干燥徹底。特別是溶樣溶劑如果是大極性時(shí)，更要干燥徹底。否則，會(huì)影響洗脫時(shí)的實(shí)際洗脫比例，導(dǎo)致分離效率過低。樣品：粗硅膠：溶劑的大概比例為1:1~2：2左右，具體比例還要根據(jù)樣品的溶解性和粘稠性確定。難溶、粘稠的樣品，硅膠和溶劑的比例就越高。硅膠過少會(huì)讓粘稠難溶的樣品粘結(jié)成團(tuán)，無法均勻分散，洗脫的時(shí)候，洗脫劑只會(huì)沖洗到團(tuán)塊的表面，而洗不到團(tuán)塊的內(nèi)部。導(dǎo)致拖尾嚴(yán)重和回收率損失。硅膠過多則造成浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)造成拖尾。四、上樣。有干法上樣和濕法上樣兩種濕法上樣：對于在較弱極性溶劑（如石油醚）中易溶且流動(dòng)性良好不粘稠的樣品，可以用濕法上柱。就是把樣品直接用溶劑溶解，直接滴加到硅膠柱上，選取的溶劑有講究，最好極性是略小于過柱起始洗脫的溶劑。溶解的容積比例最好不要超過1:3，否則，上樣太長，影響分離效果。如果待分離樣品是流動(dòng)性良好的液體，可以不加溶劑稀釋直接上樣。上柱的時(shí)候同樣應(yīng)盡量保持硅膠柱上端面的平整。四、上樣。有干法上樣和濕法上樣兩種

干法和濕法上樣的共同注意事項(xiàng)：盡量不要破壞硅膠柱上端面的平整。越平整越好。干法優(yōu)缺點(diǎn)：干法上樣理論上適用于所有樣品。但這個(gè)方法的缺點(diǎn)就是制砂過程太費(fèi)時(shí)、費(fèi)事，又浪費(fèi)溶劑。產(chǎn)品熱穩(wěn)定性不好時(shí)，操作上要特別小心。否則容易壞掉。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF，DMSO等，會(huì)隨著溶劑一起走，顯色是一個(gè)很長的脫尾），這時(shí)就必須用干法上柱了。濕法優(yōu)缺點(diǎn)：濕法上樣的優(yōu)點(diǎn)是快速。缺點(diǎn)是適用范圍窄。如果樣品的溶解性不好，就會(huì)造成樣品在柱子里析出來，導(dǎo)致樣品與硅膠結(jié)塊成團(tuán)。特別是用溶解性好的溶劑上樣，用溶解性不太好的溶劑做起始洗脫。很容易發(fā)生這種情況。這種情況較多發(fā)生在用DCM、甲醇洗脫體系，因?yàn)檫@個(gè)體系里甲醇極性大，但溶解性弱。如果是PE/EA體系，如果溶樣溶劑的EA比例太高，也可能會(huì)發(fā)生這種情況。。五、淋洗和收集。

柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：100mg上樣量，3-5g硅膠H,1-2ml收一餾分。

六、檢測。

要更多地使用專用噴顯劑．如果僅用紫外燈，會(huì)損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑低1—2個(gè)數(shù)量級(jí)。這一段已經(jīng)有其他的人給你們培訓(xùn)過點(diǎn)板。我這里就不再重復(fù)。

七、樣品最后處理。

收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左石所謂的“硅膠”峰．經(jīng)驗(yàn)分享一：關(guān)于柱子的選擇應(yīng)該是粗長的最好。柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就小（反映在柱子上就是樣品層比較?。@樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子10厘米，而樣品曾就有2厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑饅饅沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，成本和環(huán)保就是一個(gè)大問題。不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的也不計(jì)成本的人說）。不過溶劑重蒸回收后也就減小了部分浪費(fèi).現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1:5—10，書中寫硅膠量是樣品量的30一40倍．具體的選擇要具體分析．如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.2~0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cmX20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要多用硅膠、加大柱子，也可以減小淋洗劑的極性等等。經(jīng)驗(yàn)分享二：關(guān)于淋洗溶劑的選擇洗脫劑的選擇，過柱洗脫劑的選擇往往是由點(diǎn)板展開劑決定的，感覺上要使所需點(diǎn)在rf0.2一0.3左右的比較好。不要認(rèn)為在板上爬高了分的比較開．過柱子就用那種極性，如果rf在0.6．即使相差0.2也不容易在柱子上分開，因?yàn)橹邮且粋€(gè)多次爬板的狀態(tài)，可以通過公式的比較：0.8/0.6一次的分離度，肯定不如（0.3/0.2）的三次方或四次方大，但是也不是絕對的，特別是針對難溶性的樣品，因?yàn)辄c(diǎn)板的時(shí)候，一般都不用考慮板的載量問題，但是過柱就必須考慮。溶解性太差就會(huì)造成柱載量很低，過載的情況下，往往分離效率和回收率都很低。選取的原則是在溶解性和極性之間平衡考慮，極性最好控制所要產(chǎn)物的Rf<0.5，超過分離效果就會(huì)很差，最好是0.2-0.3之間。如果在該極性條件下，樣品溶解度太差，就要適當(dāng)犧牲極性、適當(dāng)提高溶解性。比如由PE/EA體系轉(zhuǎn)換成DCM/乙醚的體系。經(jīng)驗(yàn)分享三：關(guān)于操作過程1、裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤滑利，會(huì)被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟的。干法和濕法裝柱覺得沒太大區(qū)別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會(huì)從一側(cè)斜著下來）。書中寫的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數(shù)悄況卜有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就慢慢消失。但是大氣泡不行。當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習(xí)了．柱子最忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會(huì)影響分離效果，特別是豎的，甚至作廢！經(jīng)驗(yàn)分享三：關(guān)于操作過程二、加樣用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂下方時(shí)，再加少量的低極性溶劑．然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段跟離（1一3cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶樣溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。經(jīng)驗(yàn)分享三：關(guān)于操作過程三、洗脫洗脫時(shí)的流速和壓力控制，理論上柱子的分離效率與流速?zèng)]有太大關(guān)系，反而是越快越好，但是由于實(shí)際裝填的柱子，密實(shí)性和均勻性都不可能達(dá)到理想狀態(tài)，所以應(yīng)該控制適當(dāng)?shù)牧魉?，不能太快，合理的流速可以讓流?dòng)相在不均勻的柱子里有足夠的時(shí)間重新自我平衡，從而提高分離效率。還有就是高流速必須要有高壓力，普通的玻璃柱，耐壓都不能超過3atm，越大的柱子越不耐壓。安全角度考慮，最好不能超過1.5atm。直徑超過25cm的玻璃柱子，基本就不能再加壓了。流速也不能太慢，前面說了，太慢的話，會(huì)由于各組分的無序擴(kuò)散，降低分離度。鑒于此，大尺寸的柱子就必須用粗硅膠做填料，而不能用細(xì)硅膠。用細(xì)硅膠，在不能加壓的情況下，流速會(huì)很慢既浪費(fèi)時(shí)間、效果也會(huì)很差。所以過柱的時(shí)候，只要確保安全，1.5atm以下的加壓對于分離效率不會(huì)有什么影響，但可以大大節(jié)省時(shí)間。在上樣和剛剛開始洗脫時(shí)，在柱子還沒完全平衡的情況下，盡量不要上太大的壓力，一般上樣層粘稠阻力較大，馬上加壓很容易會(huì)把上樣層擊穿，一旦擊穿，柱子的整體性就被毀了。這就好比跑馬拉松比賽有些人抄了近道。！經(jīng)驗(yàn)分享三：關(guān)于操作過程4、樣品的收集首先，每個(gè)收集容器都要依次編號(hào)，否則一旦弄亂了，就將前功盡棄。理論上每個(gè)收集單位收集流出液越少越好，但太少了，所需要的收集單元就越多，勞動(dòng)量太大。每管收集太多，容易把原本分開的組分重新混起來收集在了一根試管里。所以一般我們控制每個(gè)收集單位不超過上樣量20倍體積。如果是小量過柱，我們可以一口氣收集50管甚至100管以上，然后每隔10管取一個(gè)樣，把若干個(gè)樣同時(shí)點(diǎn)在一塊板上，先找到產(chǎn)品大約在什么位置，然后再在起點(diǎn)和終點(diǎn)附近精確定位，也是一塊板上多個(gè)點(diǎn)，這樣的話只要3-4塊板基本就能把要的組分確定下來，大大提高工作效率。采用這種方法過柱，只要編號(hào)不亂，可以同時(shí)過好幾根柱子，工作效率可以翻幾倍。邊過柱邊點(diǎn)板，往往造成效率低下。浪費(fèi)層析板。有時(shí)來不及更換收集瓶，會(huì)流到外面來。好處就是需要的組分出完了，就可以及時(shí)終止，可以節(jié)約溶劑。但對于小量的過柱，溶劑用量有限，浪費(fèi)時(shí)間反而更不值得。另外用硅膠作固定相過柱子的原理是一個(gè)吸附與解吸的平衡。有時(shí)候會(huì)發(fā)生后面的點(diǎn)先出，而前面的點(diǎn)后出。這是因?yàn)槿绻麡悠放c硅膠的吸附比較強(qiáng)的話，就不容易流出。經(jīng)驗(yàn)分享三：關(guān)于操作過程5、最后的處理柱分后的產(chǎn)品，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質(zhì)也會(huì)累積到產(chǎn)品中，所以如果想送分析．最好用少量的濟(jì)劑洗滌一下，因?yàn)榇蟛糠值碾s質(zhì)是溶在溶劑里的，一洗基本就沒了，必要時(shí)進(jìn)行重結(jié)晶。經(jīng)驗(yàn)分享四：關(guān)于操作過程中其他情況另外，在過柱的時(shí)候，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)氣泡，一是和使用的溶劑有關(guān)，如果是易揮發(fā)的溶劑，如乙醚、二氯甲烷等，在室溫稍高的情況下，很容易出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因此，在室溫高的時(shí)候，可以選擇沸點(diǎn)較高，揮發(fā)相對小的溶劑。還有．使用混合溶劑時(shí)，使用的兩種溶劑的沸點(diǎn)應(yīng)該相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚（