生物化學(xué)第篇專(zhuān)題篇基因診斷與基因治療課件完整版

生物化學(xué)第篇專(zhuān)題篇基因診斷與基因治療（優(yōu)選）生物化學(xué)第篇專(zhuān)題篇基因診斷與基因治療基因變異致病類(lèi)型內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵第一節(jié)基因診斷GeneDiagnosis

（二）、分類(lèi)DNA診斷—以DNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法。RNA診斷—以mRNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法。一、基因診斷的概念和特點(diǎn)（一）、定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。（三）、特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)特異性高靈敏度高適用性強(qiáng)，診斷范圍廣二、基因診斷常用技術(shù)方法

（一）、核酸分子雜交技術(shù)（二）、聚合酶鏈反應(yīng)（三）、基因測(cè)序（四）、基因芯片（五）、DNA指紋基因診斷的概念、特點(diǎn)、常用的技術(shù)方法及應(yīng)用。指將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。構(gòu)建安全、高效、靶向、可控載體指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。（一）、核酸分子雜交技術(shù)核酸序列分析、基因表達(dá)分析、尋找新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測(cè)等GeneTherapyRNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。一、基因診斷的概念和特點(diǎn)AGCTGTGTAAGTCGTG限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性若發(fā)生在限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶切水解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段。核酸探針是一類(lèi)具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。TCGACACATTCAGCACAbnormalprotein三、基因治療的應(yīng)用與展望（一）、核酸分子雜交(molecularhybridization)技術(shù)

核酸分子雜交可用以檢測(cè)樣本中是否存在與探針序列互補(bǔ)的同源核酸序列。

核酸探針是一類(lèi)具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。

探針是能夠同某種待研究的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子，經(jīng)標(biāo)記之后可用來(lái)檢測(cè)目的DNA/RNA或蛋白質(zhì)分子。

實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA→(限制酶切)→凝膠電泳→膜轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影→分析建立在核酸雜交技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法1、限制性?xún)?nèi)切酶(restrictionendonuclease)酶譜分析法2、DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析法3、等位基因特異寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)探針雜交法即測(cè)定某一基因的堿基序列。3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、操作、回輸（一）、核酸分子雜交技術(shù)RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。特異性轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用困難可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞病毒滴度低107pfu/ml是利用特異的引物，特異地?cái)U(kuò)增目的DNA的方法。RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知Abnormalprotein早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。病毒滴度高1010pfu/ml病毒蛋白可引起免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性若發(fā)生在限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶切水解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段。RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。AGCTGTGTAAGTCGTG①反義(antisence)核酸技術(shù)鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析核酸探針是一類(lèi)具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。Abnormalprotein1、限制性?xún)?nèi)切酶酶譜分析法

是利用限制性?xún)?nèi)切酶和特異性DNA探針來(lái)檢測(cè)是否存在基因變異的一種方法?！罬stⅡ酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析A→T

+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析2、DNA-RFLP分析法

中性突變是指在人基因組中，平均每200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異的現(xiàn)象。DNA多態(tài)性是指中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性若發(fā)生在限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶切水解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段。RFLP分析法3、ASO雜交法根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)是否存在等位基因突變。ASO雜交法探針：MNMNMNMN

正?；蚣兒贤蛔冸s合突變基因缺陷（新的突變類(lèi)型？）+﹣（二）、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

是利用特異的引物，特異地?cái)U(kuò)增目的DNA的方法。實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA→PCR→凝膠電泳→顯色→分析5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA555555551、基本工作原理Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。2、常用的PCR方法：

常規(guī)PCR、巢式PCR、多重PCR、多種PCR、不對(duì)稱(chēng)PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA差異顯示PCR、原位PCR、實(shí)時(shí)PCR等等。3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、操作、回輸TCGACACATTCAGCAC①反義(antisence)核酸技術(shù)脂質(zhì)體無(wú)感染能力無(wú)特異性靶細(xì)胞脂質(zhì)體無(wú)感染能力無(wú)特異性靶細(xì)胞5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控五、外源基因表達(dá)的篩選利用載體中的標(biāo)記基因五、外源基因表達(dá)的篩選利用載體中的標(biāo)記基因1、基因矯正(genecorrection)TCGACACATTCAGCAC在人基因組DNA中有高度可變的“小衛(wèi)星”區(qū)域，采用“小衛(wèi)星”基因探針，在同一限制酶切產(chǎn)物的DNA雜交圖譜上，同一個(gè)體不同組織來(lái)源的DNA的譜帶完全一致，而不同個(gè)體之間（同卵雙生除外）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個(gè)體特異性一樣，因此這種雜交圖譜被稱(chēng)為DNA指紋或遺傳指紋（geneticfingerprint）。TCGACACATTCAGCAC①反義(antisence)核酸技術(shù)腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。Genecorrection六、回輸體內(nèi)靜脈回輸自體骨髓移植腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知是利用特異的引物，特異地?cái)U(kuò)增目的DNA的方法?？筛咝мD(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞病毒滴度低107pfu/mlRNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。3、在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶譜法PCR-STR（短串聯(lián)重復(fù)序列，shorttandemrepeat）

SSCP是指相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)泳動(dòng)速率不同的現(xiàn)象。

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR-SSCP分析是指PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。正常人純合突變雜合突變Leber遺傳性神經(jīng)病患者PCR/SSCP分析（線粒體DNA第11778位G→A所致）+﹣（三）、基因測(cè)序(genesequencing)

即測(cè)定某一基因的堿基序列。實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA→分離出有關(guān)基因→測(cè)序→分析診斷

基因測(cè)序的方法：化學(xué)裂解法DNA鏈末端合成終止法DNA自動(dòng)測(cè)序（四）、基因芯片（genechip)

基因芯片，又稱(chēng)DNA芯片、DNA陣列、寡核苷酸微芯片（DNAchip、DNAarrays、oligonucleotidemicro-chip）—是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果?；蛐酒膽?yīng)用1、在診斷中的應(yīng)用核酸序列分析、基因表達(dá)分析、尋找新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測(cè)等2、在藥學(xué)研究中的應(yīng)用藥物篩選、藥物作用機(jī)制研究、耐藥菌株、藥敏檢測(cè)、毒理學(xué)研究、環(huán)境化學(xué)毒物的篩選、基因掃描等（五）、DNA指紋(DNAfingerprint)

在人基因組DNA中有高度可變的“小衛(wèi)星”區(qū)域，采用“小衛(wèi)星”基因探針，在同一限制酶切產(chǎn)物的DNA雜交圖譜上，同一個(gè)體不同組織來(lái)源的DNA的譜帶完全一致，而不同個(gè)體之間（同卵雙生除外）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個(gè)體特異性一樣，因此這種雜交圖譜被稱(chēng)為DNA指紋或遺傳指紋（geneticfingerprint）。簡(jiǎn)言之：DNA指紋或遺傳指紋是指采用“小衛(wèi)星”基因探針進(jìn)行DNA分子雜交（Southern印跡，Southernblotting）所得的圖譜。實(shí)驗(yàn)流程：提取DNA→限制酶切→凝膠電泳→膜轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影→分析三、基因診斷的應(yīng)用遺傳疾病腫瘤感染性疾病傳染性流行病判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定總結(jié)

基因診斷的概念、特點(diǎn)、常用的技術(shù)方法及應(yīng)用。MstⅡ酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)可通過(guò)細(xì)胞屏障而發(fā)揮作用RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知PNA技術(shù)是利用多肽與DNA的特異性結(jié)合，專(zhuān)一地抑制某一基因的表達(dá)。5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控（二）、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（新的突變類(lèi)型？）核酸序列分析、基因表達(dá)分析、尋找新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測(cè)等指將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。SSCP是指相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)泳動(dòng)速率不同的現(xiàn)象。精密調(diào)控外源基因在人體內(nèi)的表達(dá)基因診斷、DNA診斷、RNA診斷、根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)是否存在等位基因突變。五、外源基因表達(dá)的篩選利用載體中的標(biāo)記基因5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控是利用特異的引物，特異地?cái)U(kuò)增目的DNA的方法。AGCTGTGTAAGTCGTGDNA鏈末端合成終止法（三）、基因治療的其他方法根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)是否存在等位基因突變。5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控復(fù)習(xí)題1、名詞解釋?zhuān)夯蛟\斷、DNA診斷、RNA診斷、RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指紋2、簡(jiǎn)述基因診斷的特點(diǎn)、常用技術(shù)方法及可用于診斷的疾病。簡(jiǎn)述基因變異致病的類(lèi)型及內(nèi)源性基因變異的類(lèi)型。簡(jiǎn)述限制性?xún)?nèi)切酶譜分析法、ASO探針雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指紋等的實(shí)驗(yàn)流程。第二節(jié)基因治療GeneTherapy（一）、基因治療的概念早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。目前廣義上來(lái)講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。一、基因治療的概念（二）、基因治療的基本方法1、基因矯正(genecorrection)2、基因置換(genereplacement)3、基因增補(bǔ)(geneaugmentation)4、基因失活(geneinactivation)

1、基因矯正(genecorrection)

指將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。納米鉗AGCTGTGAAGTCGTGTCGACACTTCAGCACabnormalgeneGenecorrectionnormalgeneTACG2、基因置換(genereplacement)指用正常的基因通過(guò)體內(nèi)基因同源重組，原位替換致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。SSCP是指相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)泳動(dòng)速率不同的現(xiàn)象。某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)樽詺⒒颉＃ㄎ澹?、DNA指紋(DNAfingerprint)某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)樽詺⒒?。在不分裂?xì)胞中可進(jìn)行高效率只有短暫表達(dá)簡(jiǎn)述限制性?xún)?nèi)切酶譜分析法、ASO探針雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指紋等的實(shí)驗(yàn)流程。腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知4、基因失活(geneinactivation)指將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。1、基因矯正(genecorrection)指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。體細(xì)胞移植和重建的生物學(xué)研究二、基因治療的基本程序RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。（三）、基因治療的其他方法某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)樽詺⒒?。穩(wěn)定整合于宿主基因組隨機(jī)整合可能導(dǎo)致突變載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)4、基因失活(geneinactivation)某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)樽詺⒒颉eber遺傳性神經(jīng)病患者PCR/SSCP分析中性突變是指在人基因組中，平均每200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異的現(xiàn)象。AGCTGTGCAAGTCGTGTCGACACGTTCAGCACnormalgeneAGCTGTGCAAGTCGTGTCGACACGTTCAGCACnormalgeneAGCTGTGTAAGTCGTGTCGACACATTCAGCACabnormalgeneGenereplacement3、基因增補(bǔ)(geneaugmentation)將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，不去除異?；?，而是通過(guò)目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)缺陷基因的功能或使原有基因表達(dá)增強(qiáng)。AGCTGTGCAAGTCGTGTCGACACGTTCAGCACnormalgeneAGCTGTGTAAGTCGTGTCGACACATTCAGCACabnormalgeneGeneaugmentation4、基因失活(geneinactivation)指將特定的序列導(dǎo)入細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，已達(dá)到治療疾病的目的。幾種常見(jiàn)的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù)肽核酸基因敲除①反義(antisence)核酸技術(shù)

是指用人工合成的RNA或DNA來(lái)阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。反義RNA技術(shù)反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)，且能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因表達(dá)的RNA。反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA水平上封閉基因表達(dá)，最終可通過(guò)調(diào)節(jié)劑量，來(lái)治療由基因突變或過(guò)度表達(dá)所致的疾病或嚴(yán)重感染性疾病。TCGACACATTCAGCACAGCTGTGTAAGTCGTGabnormalgeneGeneinactivationabnormalmRNAUCGACACAUUCAGCAC反義RNAAGCUGUGUAAGUCGUGAbnormalproteinAbnormalprotein②核酶(ribozyme)技術(shù)通過(guò)核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，催化對(duì)靶RNA分子的剪切，從而破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾病的目的。5’3’5’3’靶RNA核酶分子核酶技術(shù)③三鏈技術(shù)(triplexapproach)又稱(chēng)為反基因策略(antigenestragegy)，是利用脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA專(zhuān)一性序列結(jié)合，形成三鏈DNA，從而在轉(zhuǎn)錄水平或復(fù)制水平阻止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù)。能形成三鏈DNA的脫氧寡核苷酸稱(chēng)為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸（triplex-formingoligonucleotide,TFO)。復(fù)制、轉(zhuǎn)錄三鏈DNA技術(shù)五、外源基因表達(dá)的篩選利用載體中的標(biāo)記基因某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)樽詺⒒颉?、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控AGCTGTGCAAGTCGTG鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析可通過(guò)細(xì)胞屏障而發(fā)揮作用脂質(zhì)體無(wú)感染能力無(wú)特異性靶細(xì)胞直接體內(nèi)療法(invivo)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。穩(wěn)定整合于宿主基因組隨機(jī)整合可能導(dǎo)致突變核酸分子雜交可用以檢測(cè)樣本中是否存在與探針序列互補(bǔ)的同源核酸序列。簡(jiǎn)述限制性?xún)?nèi)切酶譜分析法、ASO探針雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指紋等的實(shí)驗(yàn)流程。自殺基因③三鏈技術(shù)(triplexapproach)根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)是否存在等位基因突變。即測(cè)定某一基因的堿基序列。AGCTGTGTAAGTCGTG指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。①反義(antisence)核酸技術(shù)法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別、親子鑒定GenecorrectionGenereplacement④干擾RNA(interferenceRNA,RNAi)技術(shù)RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(singlestrandRNAi)。RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解干擾RNA技術(shù)RNAiRNAi技術(shù)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)效率性高作用時(shí)間長(zhǎng)可通過(guò)細(xì)胞屏障而發(fā)揮作用⑤肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)技術(shù)PNA是指DNA-肽復(fù)合物。

PNA技術(shù)是利用多肽與DNA的特異性結(jié)合，專(zhuān)一地抑制某一基因的表達(dá)。肽肽核酸技術(shù)⑥基因敲除(geneknock-out)技術(shù)指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。（三）、基因治療的其他方法1、“自殺基因”的應(yīng)用某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無(wú)毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)樽詺⒒颉Ｗ詺⒒驘o(wú)毒、低毒的藥物前體→→→細(xì)胞毒性產(chǎn)物→細(xì)胞死亡2、基因疫苗的應(yīng)用將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。重組表達(dá)質(zhì)粒外源性抗原基因基因疫苗核酸探針是一類(lèi)具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。指將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。AGCTGTGTAAGTCGTG3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、操作、回輸SSCP是指相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)泳動(dòng)速率不同的現(xiàn)象?？商禺愓嫌谌巳旧w19q需腺病毒輔助復(fù)制Genecorrection反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA水平上封閉基因表達(dá)，最終可通過(guò)調(diào)節(jié)劑量，來(lái)治療由基因突變或過(guò)度表達(dá)所致的疾病或嚴(yán)重感染性疾病。反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA水平上封閉基因表達(dá)，最終可通過(guò)調(diào)節(jié)劑量，來(lái)治療由基因突變或過(guò)度表達(dá)所致的疾病或嚴(yán)重感染性疾病。（新的突變類(lèi)型？）腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知五、外源基因表達(dá)的篩選利用載體中的標(biāo)記基因腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知核酸探針是一類(lèi)具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。Genecorrection核酸探針是一類(lèi)具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)是否存在等位基因突變。腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。對(duì)宿主無(wú)害可能會(huì)于有復(fù)制能力的病毒重組①反義(antisence)核酸技術(shù)二、基因治療的基本程序一、治療性基因的選擇目的基因的選擇二、基因載體的選擇三、靶細(xì)胞的選擇四、基因轉(zhuǎn)移五、外源基因表達(dá)的篩選

利用載體中的標(biāo)記基因有neor標(biāo)記基因時(shí)，用418進(jìn)行篩選六、回輸體內(nèi)靜脈回輸自體骨髓移植埋入皮下組織病毒載體**非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞間接體內(nèi)療法(exvivo)直接體內(nèi)療法(invivo)常見(jiàn)基因載體的優(yōu)缺點(diǎn)載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組小并且簡(jiǎn)單僅感染分裂細(xì)胞穩(wěn)定整合于宿主基因組隨機(jī)整合可能導(dǎo)致突變生物學(xué)特性清楚常常只有短暫表達(dá)可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞病毒滴度低107pfu/ml對(duì)宿主無(wú)害可能會(huì)于有復(fù)制能力的病毒重組腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知可特異整合于人染色體19q需腺病毒輔助復(fù)制以人細(xì)胞作為宿主攜帶外源基因能力有限無(wú)毒，無(wú)致病性難得到高滴度病毒腺病毒適用于原位使用，尤其是肺不與宿主基因整合在不分裂細(xì)胞中可進(jìn)行高效率只有短暫表達(dá)的體內(nèi)感染無(wú)特異性靶細(xì)胞病毒滴度高1010pfu/ml病毒蛋白可引起免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)生物學(xué)特性清楚插入外源基因能力有限脂質(zhì)體無(wú)感染能力無(wú)特異性靶細(xì)胞理論上無(wú)DNA大小限制轉(zhuǎn)染效率低毒性低僅有短暫表達(dá)，體內(nèi)應(yīng)用困難受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)感染能力轉(zhuǎn)染效率低特異性轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用困難理論上無(wú)DNA大小限制可能有免疫原性構(gòu)建靈活只有短暫表達(dá)載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

三、基因治療的應(yīng)用與展望(一）、應(yīng)用遺傳性疾病、心血管疾病、腫瘤、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病1、是單基因缺陷病2、是體細(xì)胞病3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、操作、回輸4、治療效果甚于危害5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明符合嚴(yán)格的安全標(biāo)準(zhǔn)基因治療研究的病種應(yīng)該符合的條件簡(jiǎn)言之：DNA指紋或遺傳指紋是指采用“小衛(wèi)星”基因探針進(jìn)行DNA分子雜交（Southern印跡，Southernblotting）所得的圖譜。六、回輸體內(nèi)靜脈回輸自體骨髓移植TCGACACATTCAGCAC③三鏈技術(shù)(triplexapproach)將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，不去除異常基因，而是通過(guò)目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)缺陷基因的功能或使原有基因表達(dá)增強(qiáng)。5、無(wú)需嚴(yán)格的表達(dá)水平調(diào)控3、在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法GeneTherapyTCGAC