高效液相色譜分析

高效液相色譜分析第一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二第九章高效液相色譜分析第二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二1-1高效液相色譜法與氣相色譜比較氣相色譜法分析樣品限于氣體和沸點(diǎn)較低的具有揮發(fā)性的化合物。液相色譜法分析的樣品不受樣品揮發(fā)和熱穩(wěn)定性的限制。氣相色譜法采用的流動(dòng)相是惰性氣體，他對(duì)被分離組分不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而液相色譜中的流動(dòng)相可選用多種多樣的不同極性的液體，他對(duì)被分離組分可產(chǎn)生一定的作用力。氣相色譜分析一般在較高的溫度下進(jìn)行，而液相色譜則在常溫條件下工作，并可對(duì)分析樣品回收和純化制備。高效液相色譜是具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)。第三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二（1）高壓：以液體為流動(dòng)相，流經(jīng)色譜柱受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì)液體施加高壓150-350×105Pa。（2）高速：高的分析速度。（3）高效：采用5一10μm微粒固定相以提高柱效，可達(dá)3萬塔板/米。（4）高靈敏度：設(shè)計(jì)高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測(cè)器，提高檢測(cè)靈敏度。

第四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二一、液-固色譜法(液-固吸附色譜法)基本原理：

固定相多為固體吸附劑，在表面上存在著吸附中心。組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸，不同的分子由于固定相上的吸附作用不同而得到分離。適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；1-2主要分離類型與原理第五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二固定相：分為極性和非極性兩大類。極性固體吸附劑為：硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂及分子篩等。非極性固體吸附劑為：活性炭。溶質(zhì)分子與極性吸附中心的作用力會(huì)隨著溶質(zhì)分子上官能團(tuán)極性的增加或官能團(tuán)數(shù)目的增加而增加，保留值增大。不同類型的有機(jī)化合物，在極性吸附劑上的保留順序如下：氟碳化合物＜飽和烴＜烯烴＜芳烴＜有機(jī)鹵化物＜醚＜硝基化合物＜腈＜酯、酮、醛＜醇＜羧酸第六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二二、液-液分配色譜

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；分配系數(shù)：

Cs和Cm分別表示溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度。流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；第七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二

液-液分配固定相（1）全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見。

（2）表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；第八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二

一般采用硅膠為載體，利用硅膠表面的硅醇基與多種有機(jī)分子成鍵，可以得到各種性能的化學(xué)鍵合固定相。三、化學(xué)鍵合固定相色譜

第九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二特點(diǎn)：（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；

（3）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（4）可用于梯度洗脫機(jī)理：由于鍵合固定相不能全部覆蓋具有吸附能力的載體，所以既不是典型的液液分配過程，也不是全部吸附過程，而是雙重機(jī)理兼而有之。第十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二四、離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長；陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）第十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二五、離子色譜(Ionchromatography，簡稱IC)以無機(jī)特別是無機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象，在20世紀(jì)70年代出現(xiàn)、80年代迅速發(fā)展。傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。第十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二（1）離子色譜法與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；在線電導(dǎo)檢測(cè)器，對(duì)離子高靈敏；快速分離分析微量無機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。第十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二（2）離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）分析速度快

數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析。（2）分離能力高

在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離。（3）分離混合陰離子的有效方法（4）耐腐蝕儀器流路采用全塑件，玻璃柱。第十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二（3）離子色譜流程與裝置類型抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型。

分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05mmol/g干樹脂。非抑制型:

當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07mmol/g干樹脂)，使用低濃度、低解離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。第十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二（4）離子色譜法的應(yīng)用雙柱陰離子分析:

薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3mm×250mm)。流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL·h-1。

七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50μg·g-1。第十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二以硫酸鈉和硝酸鈉為例說明離子色譜的分離原理：

以陰離子交換樹脂做固定相，以碳酸鈉溶液為流動(dòng)相，可以有效的分開兩種陰離子。洗脫液在進(jìn)入檢測(cè)器之前，經(jīng)過抑制柱，在抑制柱（填充有氫離子型陽離子交換劑）中把洗脫液中的高電導(dǎo)碳酸鈉交換為難解離的碳酸，與此同時(shí)硝酸根離子和硫酸根離子在抑制柱中轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸。硝酸和硫酸與碳酸不同，與其他鹽類具有更高的導(dǎo)電性，經(jīng)分離柱分離后，被電導(dǎo)檢測(cè)器檢出。第十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二六、離子對(duì)色譜原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；反相離子對(duì)色譜：以非極性固定相如ODS做填料，流動(dòng)相是很有對(duì)離子（B-）的極性溶液，當(dāng)樣品（含有被分離的離子A+）進(jìn)入色譜柱后，A-和B+相互作用生成中性的化合物AB，AB就會(huì)被疏水性的固定相分配或吸附，按照與固定相及流動(dòng)相之間的作用力大小被流動(dòng)相洗脫下來。離子對(duì)色譜是用正向或反相色譜柱分離離子和中性化合物的方法。第十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二七、尺寸排阻色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離第二十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二八、親和色譜(AC)Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

間隔基：環(huán)氧、聯(lián)胺等；

配基：酶、抗原等；

這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第二十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二1-2、液相色譜的流動(dòng)相1.流動(dòng)相特性（1）流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，正相，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。

第二十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二2.流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：底劑和淋洗劑。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。3.常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)第二十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二3.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題（1）流動(dòng)相純度盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相。（2）應(yīng)避免使用會(huì)引起柱效損失或者保留特性變化的溶劑。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。（5）溶劑的粘度小些為好，否則降低組分的擴(kuò)散系數(shù)，柱效下降。第二十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二1-3、液相色譜儀器第二十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150×105～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)，脈沖小，流量穩(wěn)定可調(diào)，耐腐蝕等特性。第二十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第二十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二梯度洗脫（適用對(duì)象，與程序升溫區(qū)別）

載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變分離組分的分離因素，以提高分離效果。

使保留時(shí)間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，保留時(shí)間過長而峰形扁平的組分獲得很好的分離，特別適合樣品中組分的k值范圍很寬的復(fù)雜樣品的分析。

梯度淋洗十分類似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過程序改變柱溫．而液相色譜是通過改變流動(dòng)相組成、極性、pH值來達(dá)到改變k的目的。

第二十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二二、

進(jìn)樣裝置（1）通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。（2）自動(dòng)進(jìn)樣器：按照預(yù)先設(shè)定的程序進(jìn)行操作，一次可以連續(xù)進(jìn)幾十個(gè)到幾百個(gè)樣品，適合于大量樣品分析。第二十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期二(3)高效分離柱柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑1