實驗酶切和連接

實驗酶切和連接第一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二DNA克?。ㄖ亟M）技術(shù)的基本程序包括：（1）獲得外源DNA：外源DNA是進行DNA重組的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄-DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、基因組文庫或cDNA文庫篩選等方法獲得。（2）載體的構(gòu)建或選擇：分子生物學(xué)中用的載體是指能在特定宿主細胞中自主復(fù)制的DNA分子，例如細菌的質(zhì)粒、噬菌體、病毒等，常用的載體一般為質(zhì)粒；根據(jù)需要可直接從公司購買合適的載體，也可以自己構(gòu)建。第二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二（3）連接：目的DNA片段和適當(dāng)載體的連接,一般采用核酸內(nèi)切酶分別消化DNA片段和載體，使它們的末端能夠連接到一起構(gòu)成重組DNA分子。由于所用內(nèi)切酶的切割特點不同，產(chǎn)生三種連接方式：粘端連接、平端連接和不相配的連接。（4）轉(zhuǎn)化：將連接的重組DNA產(chǎn)物導(dǎo)入合適的宿主細胞，使其在宿主細胞內(nèi)復(fù)制擴增或表達，賦予宿主細胞新的生物特征。（5）克隆化：重組DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，在平板培養(yǎng)基上篩選出單個菌落，此菌落經(jīng)過酶切鑒定或雜交實驗后確定為含重組DNA分子的單克隆。第三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二DNA克隆

DNA克隆的技術(shù)路線大致包括以下幾個程序：①分離制備待克隆的DNA片段(目的DNA)。②選擇合適的載體。③在體外連接目的DNA和載體。④將重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞，并篩選和鑒定陽性重組子。⑤擴增陽性重組子。第四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二實驗九質(zhì)粒酶切與鑒定第五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二一.實驗?zāi)康牧私赓|(zhì)粒酶切鑒定原理。掌握核酸片斷回收純化操作技術(shù)3.學(xué)習(xí)核酸片斷連接的原理和方法第六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二二.實驗原理(質(zhì)粒酶切與鑒定)使用限制性內(nèi)切酶獲得粘性末端的目的基因核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。第七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二

限制性內(nèi)切酶是一種工具酶，這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個特異性核苷酸序列內(nèi)，切斷DNA的雙鏈，形成一定長度和順序DNA片段。如：NotI的識別序列和切口是：

限制性內(nèi)切酶切口酶切片段電泳凝膠的區(qū)帶數(shù),酶切片段大小第八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二三.儀器和試劑1．主要儀器

（1）1.5mL塑料離心管

（2）微量加樣器10μL、100μL、1000μL各一支

（3）臺式高速離心機（20000r/min）

（4）水浴鍋（5）電泳儀，電泳槽

2．材料

大腸桿菌DH5α質(zhì)粒第九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二3．試劑

（1）限制性內(nèi)切酶NotI及相應(yīng)的緩沖液；

（2）電泳試劑1xTBE緩沖液

EB染色液(0.5μg/mL)。第十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二四.操作步驟1.反應(yīng)體系的建立：

⑴在一無菌1.5mlEppendorf管中加入：

無菌雙蒸水10.5μl

10×酶切緩沖液2μl

質(zhì)粒DNA(100ng/μl)7μl

NotⅠ(10U/μl)0.5μl

總體積為20μl

⑵輕輕混勻，12000rpm離心5sec。第十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二操作注意事項：

1.吸樣量一定要準(zhǔn)確

2.加樣按體積從大到小，最后加酶

3.要求在冰上操作，并充分混勻，

4.開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防污染。

5.樣品在37℃與65℃保溫時，將離心管蓋嚴，以防水進入管內(nèi)造成實驗失敗。2.37℃水浴1h。3.將Eppendorf管置65℃水浴中10min，通過加熱使酶失活以終止反應(yīng)。

第十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二4．DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

（1）水平放置膠槽，放入合適的梳子。（2）1%瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.3g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入30mLTBE緩沖液，微波爐加熱融解，待冷卻至65℃左右加入2ulEB，將凝膠液緩慢倒入膠槽，室溫下靜置30min，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，將膠板放在電泳槽中使用。

（3）加樣：用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)。第十三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二（4）電泳

120V電泳，當(dāng)指示劑前沿移動至距離膠板1~2cm處，停止電泳。

（5）觀察

紫外等下觀察瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。

第十四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二實驗十DNA片斷的回收純化及連接第十五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二一.實驗原理(目的片段的回收與連接)

載體及目的DNA片斷經(jīng)酶切后，必須電泳分離后回收目的片斷?；厥盏姆椒▊鹘y(tǒng)的方法：基于降低凝膠的熔點以釋放DNA，然后通過酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收。商品化的試劑盒：采用凝膠裂解液（如含有降低熔點的NaI）融化凝膠釋放DNA后，采用特殊的硅膠樹脂吸附DNA后，用洗液洗去雜質(zhì)，最后用洗脫液洗出DNA。

第十六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二DNA片段之間的連接主要是在DNA連接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羥基和5’磷酸之間形成共價結(jié)合的磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA裂口連接起來,需ATP。第十七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二連接酶：把基因連在一起第十八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二二.儀器和試劑1.儀器：離心機，水浴鍋，電泳儀2.材料：待回收DNA樣品

3.試劑：

1)DNA回收試劑盒

2）T4DNA連接酶

3）10XT4DNAligasebuffer：Tris-HCl（pH7.6）；MgCl2；DTT；ATP。第十九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二三.操作步驟DNA酶切條帶回收（北京艾德萊生物膠回收試劑盒）1)用干凈無菌的刀片在365nm紫外光下切割目的DNA條帶，放入1.5mLEp管中，積累凝膠至大約300ul。2)將目標(biāo)片段切下的膠轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的1.5mleppendorf管中，稱取凝膠重量。按照0.1g=100ul估算凝膠體積，3)加入3倍體積的溶膠液DD。4)56℃水浴10min或直到凝膠完全溶解。每隔2min搖蕩一次。

第二十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二5）取回收試劑盒中吸附柱EC裝在2ml收集管上，將上一步所得溶液加入吸附柱EC中。室溫放置1min,

12000rpm離心1min,棄去收集管中平衡液，將柱子套回；6）加入700ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm離心1min，棄去廢液；7）加入500ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm離心1min，棄去廢液；8）將吸附柱EC裝回收集管上，12000rpm離心2min甩干柱子中殘液；9）將吸附柱轉(zhuǎn)移到1個干凈的1.5mleppendorf管中，加入50ul洗脫緩沖液EB至柱子底部膜中央，室溫放置2min,12000rpm離心1min，收集離心液為洗脫的DNA.第二十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二2.片斷與載體連接反應(yīng)1）連接反應(yīng)液的制備：加入含有質(zhì)粒載體的DNA溶液：2μl；插入片段DNA溶液：5μl；

10XT4DNAligasebuffer：1μl；

T4DNA連接酶：0.5μl

滅菌的雙蒸水：1.5μl

總體積為10μl

渦旋后混合均勻，渦旋至無氣泡。2）16℃反應(yīng)過夜。第二十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二注意：DNA純化回收后,電泳檢測應(yīng)為單一的條帶。如果切膠過程中不慎帶上雜帶,那么回收后電泳結(jié)果可能會出現(xiàn)兩條以上的帶。這時可以進行重復(fù)純化回收。2.當(dāng)連接反應(yīng)難以進行時，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間。