第五章-植物細胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)課件

第五章植物細胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

第一節(jié)懸浮培養(yǎng)

愈傷組織的誘導和懸浮細胞系的建立Cellsuspensionculture:將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。愈傷組織誘導和培養(yǎng)條件優(yōu)化1、愈傷誘導（紫草為例）先獲得無菌苗外植體誘導愈傷注意：2，4－D的合理使用2、培養(yǎng)條件優(yōu)化在系列單因子比較試驗基礎上，獲得最合適的培養(yǎng)條件組合。懸浮細胞系的建立成功的懸浮細胞系：1、懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小。2、均一性好：細胞形狀和細胞團大小大致相同。3、生長迅速幾個重要的生長、生產(chǎn)衡量指標絕對生長速率：Ra=(w2-w1)/(t·v),w2、w1分別為培養(yǎng)物的最終和起始干重(g)，t為培養(yǎng)時間(d),v為培養(yǎng)基體積(L)。產(chǎn)物含量％干重表示：產(chǎn)物占愈傷組織干重的百分比。產(chǎn)物產(chǎn)量：每升培養(yǎng)基生產(chǎn)的產(chǎn)物量（mg)。懸浮培養(yǎng)細胞的同步化1、分選法梯度離心；Ficoll；流式細胞儀2、饑餓法3、抑制劑法FdU，HU4、低溫處理低溫處理抑制細胞分裂，再把溫度提高到正常的培養(yǎng)溫度，也可達到部分同步化。第二節(jié)單細胞培養(yǎng)1、平板培養(yǎng)（platingculture)：將一定密度懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術。2、看護培養(yǎng)（nurseculture)3、微室培養(yǎng)（micro-chamberculture)4、其它：飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術、雙層濾紙植板培養(yǎng)技術第三節(jié)植物細胞的規(guī)模培養(yǎng)20%左右的藥物由植物衍生已有30多種化合物在培養(yǎng)物中積累接近或超過原植物含量日本三井石油化學公司產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫草寧植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)需滿足的條件1、培養(yǎng)的細胞遺傳上穩(wěn)定，得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物；2、細胞生長及生物合成的速度快，短時間內(nèi)得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物；3、代謝產(chǎn)物要在細胞內(nèi)積累而不被迅速分解，最好釋放到培養(yǎng)基中。植物細胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立1、種子細胞的選擇單細胞克隆結(jié)合誘變和壓力篩選2、種子細胞系的增殖與放大培養(yǎng)3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立成批培養(yǎng)（batchculture)、飼喂批量培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）；半連續(xù)培養(yǎng)

利用生物反應器進行細胞大量培養(yǎng)1、攪拌式：可直接借用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗。但剪切力高。2、氣動式：反應器內(nèi)傳熱、傳質(zhì)良好。但驅(qū)除了CO2C2H4等有利氣體，能量利用率低。3、固定化細胞反應器：優(yōu)點：⑴固定化細胞易回收⑵固定化細胞有一定程度分化，利于次生代謝⑶環(huán)境條件易控制，細胞穩(wěn)定⑷適于進行生物轉(zhuǎn)化缺陷：代謝產(chǎn)物必須是分泌到胞外的第四節(jié)培養(yǎng)細胞的次生代謝及產(chǎn)物積累初生代謝產(chǎn)物：淀粉、糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等次生代謝產(chǎn)物：由初生代謝產(chǎn)物經(jīng)過一些獨特的代謝途徑派生出來的小分子化合物，種類繁多，結(jié)構(gòu)各異，包括酚類、黃酮類、香豆素、木質(zhì)素、生物堿、有機酸、糖苷、萜類等。不是植物有機體最主要的成分，但在保持植物抗逆性、抗病性和抗蟲性及擔當信號分子方面起重要作用。植物次生代謝產(chǎn)物一直是藥物和工業(yè)原料的重要來源。植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的意義Plantcellculture:在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)使其增殖的技術。植物資源短缺：濫采濫挖資源植物栽培的缺陷：占用耕地、受地域氣候限制植物細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢：可擺脫對植物資源的依賴，保護物種多樣性和生態(tài)環(huán)境。植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的研究歷史20世紀50年代——

德、美、英、加拿大

由煙草、蔬菜細胞培養(yǎng)開始，80年代后集中于藥用植物的組培、藥用成分的研究。日本：80年代末，NittoDenko公司在20kl生物反應器中實現(xiàn)紫草和人參的大規(guī)模細胞培養(yǎng)，以獲得紫草素和人參皂苷，首先作為天然食品添加劑進入市場。國內(nèi)研究成果國內(nèi)研究集中于藥用植物20世紀60年代，羅士韋首先開展人參的組培。1980年起，植物所葉和春主持國家攻關植物細胞大量培養(yǎng)方面的專題：紫草、新疆紫草、人參、三七、紅豆杉、青蒿。與化工冶金（現(xiàn)過程工程）研究所合作進行小試和中試。建立了新疆紫草高產(chǎn)細胞系。藥用植物細胞大量培養(yǎng)的三個步驟1、誘導植物產(chǎn)生旺盛生長的愈傷組織和懸浮細胞系2、篩選高產(chǎn)細胞系3、生物反應器中大量培養(yǎng)細胞或細胞團。高產(chǎn)細胞系的篩選1、根據(jù)細胞表型進行篩選2、根據(jù)單細胞克隆次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量篩選。兩步培養(yǎng)法1、藥用植物組培中為何經(jīng)常采用兩步法？許多植物組培研究表明，促進細胞生長的條件和促進次生代謝物生產(chǎn)的條件并不相同，一些促進細胞生長的因子往往抑制次生代謝物的合成和積累。因此宜用兩步法。2、何為二步法？第一步，愈傷培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基上使細胞快速增殖。第二步，細胞生長通過指數(shù)生長期后，轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)培養(yǎng)基上進行第二步培養(yǎng)，以獲得最高次生產(chǎn)物產(chǎn)量。紫草兩步培養(yǎng)的經(jīng)驗促進愈傷快速生長的因素：較高濃度生長素、分裂素較高濃度NH4+25℃黑暗促進紫草寧快速合成的因素：降低生長素、分裂素濃度或不加激素較低濃度NH4+較高濃度Cu2+25℃黑暗

前體及誘導子的作用前體作用：細胞培養(yǎng)物中加入前體，可減弱限速酶作用，促進次生代謝物生產(chǎn)。誘導子