炭疽檢驗技術

炭疽檢驗技術第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

炭疽是由炭疽桿菌引起的人獸共患急性、熱性、敗血性傳染病。其病理變化的特點是脾臟顯著腫大，皮下及漿膜下結(jié)締組織出血浸潤，血液凝固不良，呈煤焦油樣。人感染后多表現(xiàn)為皮膚炭疽、肺炭疽及腸炭疽，偶有伴發(fā)敗血癥。炭疽（Anthrax）第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三發(fā)病、死亡污染環(huán)境形成芽胞經(jīng)口食入食草動物通過直接接觸、消化道、呼吸道等途徑感染人類食肉動物偶爾感染

第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三革蘭氏染色陽性；長而直的大桿菌，菌體兩端平直；大小為1.0～1.5um×3～5um，致病菌中最大的；無鞭毛，不能運動。一、病原——炭疽桿菌（Bacillusanthracis）第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三莢膜染色在碳酸鹽培養(yǎng)基中、厭氧環(huán)境下生成莢膜。一、病原——炭疽桿菌（Bacillusanthracis）炭疽桿菌在病人、病畜體內(nèi)多散在或呈2～3個短鏈排列，有莢膜（紅色）第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三在活炭疽病畜體或死亡后未經(jīng)解剖的尸體內(nèi)，不形成芽胞。一旦體內(nèi)炭疽桿菌暴露于空氣中，接觸了游離氧，在一定溫度下(12--42℃)就會形成芽胞。芽胞呈卵圓形或圓形，位于菌體中央或稍偏向一端。一、病原——炭疽桿菌（Bacillusanthracis）第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三A：炭疽芽孢薄片（透射電鏡）有致密的胞膜

B：炭疽芽孢（掃描電鏡）收縮成橢圓形

C：炭疽繁殖體薄片（透射電鏡）第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

炭疽桿菌為兼性需氧菌，在12～44℃都能生長，最適生長溫度為37℃。最適pH為7.3～7.6。在普通瓊脂平皿培養(yǎng)基上生長成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，邊緣不整齊，能形成幾個或數(shù)十個菌體相連的長鏈，低倍顯微鏡觀察呈卷發(fā)狀。在血液瓊脂平皿培養(yǎng)基上，生長出濕潤粘稠的菌落，菌落周圍不溶血。二、培養(yǎng)特性第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三光鏡下炭疽桿菌菌落邊緣呈卷發(fā)狀第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三在血液瓊脂平皿培養(yǎng)基上不溶血或微溶血第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三三、致病性與免疫性致病物質(zhì):主要有二種莢膜:由質(zhì)粒編碼,具有抗吞噬作用炭疽毒素:由質(zhì)粒編碼（致死主要因素）保護性抗原（protectiveantigen，PA）水腫因子（edemafactor，EF）致死因子(lethalfactor，LF)第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三四、抵抗力芽胞抵抗力強煮沸40min或干熱140oC3h滅活；在干燥土壤或皮毛中能存活數(shù)年至20年；對化學消毒劑抵抗力強(5%石炭酸5d殺死）；對碘及氧化劑較敏感；繁殖體的抵抗力弱對青霉素、紅霉素、氯霉素敏感

第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三炭疽病原學檢查炭疽血清學檢查五、炭疽實驗室檢查第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三炭疽病原學檢查標本采集和樣品處理細菌培養(yǎng)涂片、革蘭染色、莢膜染色、光鏡檢查Ascoli試驗動力檢查噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗串珠試驗生化試驗炭疽PCR基因檢測五、炭疽實驗室檢查第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三炭疽血清學檢查標本采集和樣品處理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平檢測（酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA）血清中抗炭疽莢膜抗體膠體金檢測五、炭疽實驗室檢查第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三《人間傳染的病原微生物名錄》序號病原菌名稱危害程度分類實驗活動所需生物安全實驗室級別學名中文名大量活菌操作動物感染實驗樣本檢測非感染性材料的實驗1Bacillusanthracis炭疽芽孢桿菌第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-12Brucellaspp布魯氏菌屬第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-13Burkholderiamallei

鼻疽伯克菌

第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-14Coxiellaburnetii

伯氏考克斯體

第二類BSL-3ABSL-3BSL-2BSL-1

大量活菌操作：實驗操作涉及“大量”病原菌的制備，或易產(chǎn)生氣溶膠的實驗操作（如病原菌離心、凍干等）。動物感染實驗：特指以活菌感染的動物實驗。

樣本檢測：包括樣本的病原菌分離純化、藥物敏感性實驗、生化鑒定、免疫學實驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測活動。非感染性材料的實驗：如不含致病性活菌材料的分子生物學、免疫學等實驗。第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三炭疽病原檢驗程序標本處理（方法根據(jù)標本情況選擇）直接涂片、革蘭染色、莢膜染色、光鏡檢查接種培養(yǎng)（可用選擇性培養(yǎng)基、血培養(yǎng)基）37℃，16~48hAscoli試驗基因檢測可疑菌落（形態(tài)）初檢培養(yǎng)性鑒定試驗深入鑒定涂片、革蘭染色、莢膜染色、光鏡檢查動力檢查液體培養(yǎng)噬菌體裂解和青霉素敏感性試驗產(chǎn)莢膜培養(yǎng)及光鏡檢查串珠試驗生化試驗基因檢測酶免疫法測外毒素動物毒性測定第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三采取標本時必須遵循的兩條原則1、盡可能的在抗生素治療前采取標本；2、除必要時并在具備條件的實驗室內(nèi)，不得用解剖的方式獲取標本，所需的血液與組織標本，均應以穿刺方式取得。（一）炭疽病原學檢查——標本采集和樣品處理第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三1、血液標本所有的疑似病例和病畜，都應采取血液標本5-10ml，標本量至少應滿足下列檢查的需要：涂片進行顯微鏡檢查；接種培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng)；分離血清檢查抗體；常規(guī)血液檢查。熒光定量PCR檢測2、皮膚潰瘍標本在皮膚炭疽病人潰瘍邊緣用棉拭子擦拭，沾取分泌物。（一）炭疽病原學檢查——標本采集和樣品處理第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三3、糞便與嘔吐物標本表現(xiàn)消化道癥狀的可疑病人收集糞便或嘔吐物標本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無菌的容器中。4、痰與咳碟標本表現(xiàn)為呼吸道癥狀的可疑病人應收集其痰液標本，無痰液者，應取供細菌分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，打開平皿蓋置病人口鼻10cm處；令病人對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。（一）炭疽病原學檢查——標本采集和樣品處理第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三5、腦脊液標本表現(xiàn)為腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液。6、尸體標本食草動物死于炭疽時，通常會從口、鼻、肛門等腔道開口流出血液，這種血液應是首先采取的標本。如果血液已滲入土壤，則應收集混有血液的土壤作為標本。沒有血液流出，或已不可能獲取血液標本時，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質(zhì)性臟器獲得組織標本。（一）炭疽病原學檢查——標本采集和樣品處理第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三7、肉類標本如果懷疑罹患炭疽的牲畜已被宰殺，或?qū)ι唐啡忸愡M行常規(guī)檢查時，可剪取小塊肉類標本。如有可能，特別應剪取肝臟、脾臟等富含血以及含有淋巴組織的標本。8、毛皮或其他可疑污染物品標本剪取小塊毛皮或其他可疑物品，剪碎置無菌試管內(nèi)，加適量的無菌生理鹽水浸泡。（一）炭疽病原學檢查——標本采集和樣品處理第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三9、水標本檢查水體污染時，用廣口瓶收集水樣。10、土壤標本在牲畜死亡或宰殺的地點，應取土壤標本以供檢查。一般要采集表層土壤（10cm內(nèi)），每份150g左右。（一）炭疽病原學檢查——標本采集和樣品處理第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三所有來自病人、病畜、尸體的標本都應首先進行直接涂片鏡檢。步驟：涂片、革蘭染色及莢膜染色、顯微鏡檢查鏡檢：取末稍血液或其他材料制成涂片后，染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有多量單在、成對或2～4個菌體相連的短鏈排列、竹節(jié)狀有莢膜的粗大桿菌，即可確診。（二）炭疽病原學檢查——顯微鏡檢查第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三革蘭染色（二）炭疽病原學檢查——顯微鏡檢查第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三莢膜染色（二）炭疽病原學檢查——顯微鏡檢查第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三采集到的標本均應進行細菌分離培養(yǎng)。培養(yǎng)基選用血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板和選擇性平板。（三）炭疽病原學檢查——細菌分離培養(yǎng)第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三標本處理：無菌的標本，如血液或腦脊液，直接涂布上述兩種平板，每平板0.1ml，組織標本應先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養(yǎng)基表面壓印，然后以白金耳涂開。污染或陳舊的標本，均應首先制成懸液。根據(jù)標本中含菌量的多少，可將懸液適當稀釋，或經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后，再10000rpm離心1分鐘，取富集的沉淀物。將所得的懸液沸水浴15min，冷卻后涂布上述兩種平板，每平板0.1ml。（三）炭疽病原學檢查——細菌分離培養(yǎng)第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

以上的平皿在37℃孵育過夜或24小時后，觀察培養(yǎng)情況。粗糙不發(fā)光，比較扁平，有點兒象蠟樣桿菌的菌落但較小，卷發(fā)狀。有的菌體形態(tài)不規(guī)則，有彗星狀拖尾，白或灰白色。（三）炭疽病原學檢查——細菌分離培養(yǎng)第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三在血平皿上為白色菌落，較粘，不溶血或微溶血。（三）炭疽病原學檢查——細菌分離培養(yǎng)第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

在靜止液體培養(yǎng)基中生長在上層和底部，培養(yǎng)基透明，拿起則呈絲絮狀下垂，搖之均勻混濁，無菌膜和壁環(huán)。1、肉湯生長（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三診斷炭疽簡便而快速的方法，其優(yōu)點是培養(yǎng)失效時，仍可用于診斷，因而適宜于腐敗病料及動物皮張或風干、淹浸過肉品的檢驗。但此法缺乏高度特異性，因為炭疽桿菌耐熱抗原在其他腐生芽胞桿菌也共有。新鮮、陳舊和外環(huán)境標本都可采樣20-50g，加水5-10倍，煮沸10分鐘，用雙層濾紙過濾后制成可溶性熱沉淀抗原，用于熱沉淀反應（Ascoli試驗。2、Ascoli試驗（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

取一玻璃沉淀管（直徑2-4mm，高20-40mm），將0.3ml炭疽菌沉淀血清加于小玻璃管底部，再緩緩加入采集處理的可溶性熱沉淀抗原約0.3ml于血清上層，注意勿使液面混合。置37℃5min，于兩液面間出現(xiàn)白色沉淀環(huán)為陽性。本實驗應有炭疽菌診斷抗原作陽性對照。炭疽菌沉淀血清處理的可溶性熱沉淀抗原白色沉淀環(huán)（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗2、Ascoli試驗第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

在蓋玻片周圍涂凡士林，將待檢菌的液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物用生理鹽水制成的均勻懸液滴于中央，再將凹玻片蓋于其上。迅速翻過來使蓋玻片在上，菌懸液懸成滴。置高倍鏡下觀察，細菌不應有運動。3、動力試驗（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三4、噬菌體裂解和青霉素敏感性將挑取的可疑菌落密集劃線接種于平板上，在劃線區(qū)內(nèi)一處滴一診斷用炭疽噬菌體，另一處貼一片青霉素紙片。37℃孵育8～24h后，在滴噬菌體處有透明噬菌體斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環(huán)，便宜可斷定接種物為炭疽芽胞桿菌。（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三4、噬菌體裂解和青霉素敏感性（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

制備有牛肉消化液瓊脂培養(yǎng)基的載玻片，涂種待檢菌，在一端加青霉素紙片或紙條。置平皿中于37℃培養(yǎng)4～6小時后，在低倍鏡下觀察。在有菌生長和抑菌區(qū)的臨界線處，應有明顯典型串珠形態(tài)。5、串珠試驗串珠試驗時炭疽桿菌的形態(tài)：串珠狀或長鏈狀（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

葡萄糖麥芽糖蔗糖乳糖甘露醇水楊素MRVP石蕊牛乳+++—————產(chǎn)酸，液化遲緩產(chǎn)酸不產(chǎn)氣

不產(chǎn)生靛基質(zhì)和H2S6、生化試驗API50CH/E鑒定條可以進行炭疽生化鑒定（四）炭疽病原學檢查——鑒定試驗第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

待測模板的制備：模板制備可直接從標本樣品，也可從培養(yǎng)物制。標本將炭疽桿菌接種于固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)18h，取培養(yǎng)物懸浮于1ml生理鹽水，離心，棄上清，沉淀用ph7.8TE溶液洗起懸浮，于沸水浴中煮15min。離心，上清用0.22um的濾器除菌過濾。濾液即為模板，可置4℃?zhèn)溆糜赑CR擴增。（五）炭疽病原學檢查——PCR鑒定試驗第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三cap外F：CCTGGTTGTTCTTTTCGTTGCcap外R：CGGATTGTATATGGAGTGGG產(chǎn)物大：1242bp

rpoB普1F：GTACGCCAATCGATATCATGrpoB普1R：GATCATCGTCATCTTCCGTA產(chǎn)物大小：618bp

pagA普F:ATTTGCGGTAACACTTCACTpagA普R:AGACCGTGACAATGATGGAA產(chǎn)物大?。?23bp引物序列：（五）炭疽病原學檢查——PCR鑒定試驗第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三

反應體系(50μl)10×反應緩沖液5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）4μl引物（上游）1μl引物（下游）1μl待測模板1μl無菌去離子水37μlTaqDNA聚合酶1μl

反應條件：預變性95℃5min；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃5min。（五）炭疽病原學檢查——PCR鑒定試驗第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三標本采集和樣品處理血清中抗炭疽芽胞和毒素IgG水平檢測（酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA）血清中抗炭疽莢膜抗體膠體金檢測炭疽血清學檢查第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三根據(jù)血清學檢驗的結(jié)果可以對病人做出追溯診斷，由于診斷必須由雙份血清做出，需要特別強調(diào)急性期血清的采取。首份血清應在檢視病人時采取，通常應一次采取血液標本供涂片鏡檢，細菌分離培養(yǎng)，血清學檢查及常規(guī)的血液檢查使用。血清分離后置4℃保存，待獲得恢復期血清后，一同進行抗體檢查。恢復期血清應在發(fā)病后15日左右采取。（一）炭疽血清學檢查——標本采集和樣品處理第四十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三（二）炭疽血清學檢查——

抗炭疽芽胞和毒素IgG水平ELISA測定第四十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期三抗炭疽芽胞和毒素IgG水平ELISA測定程序包被抗原：所用各孔加入檢測用炭疽標準芽胞抗原液或檢測用炭疽毒素抗原液100μl，酶標板貼上封口膜，置4℃過夜。次日，甩干孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100μl，甩干，反復洗滌3次，每次3min?！龣z血清反應：每種待測血清使用兩行，以增加測定結(jié)果的可分析性。兩行的1~12孔各加生理氯化鈉溶液100μl。在第1孔加待測血清100μl，從第1孔以倍比稀釋法向后至第12孔進行稀釋混勻。酶標板貼上封口膜，置37℃60min。甩干孔內(nèi)溶液，每孔加洗滌緩沖液100μl，甩干，反復洗滌3次，每次3min。(同時做空白、正常血清孔對照)↓酶標抗體反應：于各反應孔中加入新鮮稀釋的工作濃度的辣根過氧化物酶標記的羊（兔）抗人