講解分子技術(shù)在腫瘤靶向藥物治療的應(yīng)用演示文稿

講解分子技術(shù)在腫瘤靶向藥物治療的應(yīng)用演示文稿當(dāng)前第1頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)（優(yōu)選）講解分子技術(shù)在腫瘤靶向藥物治療的應(yīng)用當(dāng)前第2頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH

）技術(shù)

當(dāng)前第3頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)簡介FISH=FluorescenceInSituHybridization利用熒光標(biāo)記的DNA探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)與其互補(bǔ)的DNA片段應(yīng)用：遺傳病診斷血液腫瘤實(shí)體瘤樣本：羊水、絨毛、流產(chǎn)組織、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等當(dāng)前第4頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交工作原理當(dāng)前第5頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)FISH檢測染色體易位（Translocation）在淋巴瘤分型中的應(yīng)用FISH技術(shù)在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用當(dāng)前第6頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)檢測技術(shù)特點(diǎn)不同類型的淋巴瘤染色體易位類型不同優(yōu)點(diǎn)適用于形態(tài)學(xué)上難以診斷且IHC結(jié)果不理想的標(biāo)本；適用于細(xì)胞數(shù)量少，形態(tài)不典型的活檢及穿刺組織。必須結(jié)合組織形態(tài)學(xué)和免疫組化結(jié)果作最后診斷?。?！當(dāng)前第7頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)FISH基因檢測在淋巴瘤的應(yīng)用淋巴瘤FISH檢測基因臨床應(yīng)用套細(xì)胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因輔助診斷濾泡性淋巴瘤BCL2/IGH融合基因輔助診斷、判斷預(yù)后彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤BCL6基因斷裂重組輔助診斷、判斷預(yù)后伯基特淋巴瘤C-MYC基因斷裂重組輔助診斷粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤MALTI基因斷裂輔助診斷胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤API2-MALTI融合基因指導(dǎo)治療當(dāng)前第8頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）

按免疫組化亞型分為

CD5陽性DLBCL

生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型(GCB)、非生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型(non-GCB)3類可根據(jù)CD10、BCL6、MUM1的表達(dá)區(qū)分生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型、非生發(fā)中心B細(xì)胞樣變型。>30%瘤細(xì)胞表達(dá)CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)診斷為GCB;其他病例則為non-GCB。

當(dāng)前第9頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)◆BCL6基因斷裂---輔助診斷彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤◆BCL6基因斷裂重排----判斷預(yù)后目前研究確定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。

一項(xiàng)針對102名DLBCL患者的BCL6重排情況及其與預(yù)后關(guān)系的研究顯示，BCL6陽性患者診斷治療36個月后，疾病停止發(fā)展的比率為82%，攜帶有BCL6重排的病例預(yù)后較好。BCL6基因斷裂與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤當(dāng)前第10頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)當(dāng)前第11頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)Offit,K.NEnglJMed,1994.331(2):p.74-80.結(jié)果判讀當(dāng)前第12頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)IGH/CCND1融合基因可見于95%的套細(xì)胞淋巴瘤，是套細(xì)胞淋巴瘤與其他淋巴瘤鑒別的重要指標(biāo)。IGH/CCND1融合基因--輔助診斷套細(xì)胞淋巴瘤。IGH/CCND1融合基因與套細(xì)胞淋巴瘤當(dāng)前第13頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)l正常細(xì)胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l異常細(xì)胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。當(dāng)前第14頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)API2/MALT1基因檢測試劑盒

探針：GLPAPI2/GLPMALT1凋亡抑制因子2基因（apoptosisinhibitor-2,API2）,位于11號染色體;粘膜相關(guān)淋巴組織基因（Mucosa-associatedlymphoidtissue1,MALT1

），位于18號染色體。

API2基因與MALT1基因的融合導(dǎo)致凋亡抑制的增加，引起細(xì)胞不依賴于抗原刺激的生存優(yōu)勢。

當(dāng)前第15頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)

API2/MALT1融合基因的檢測可以指導(dǎo)抗HP治療胃MALT淋巴瘤與幽門螺旋桿菌（HP）感染導(dǎo)致的慢性胃炎有關(guān)，MALT1/API2融合基因陰性的患者抗HP治療有效，陽性患者抗HP治療無效。API2/MALT1融合基因檢測意義

當(dāng)前第16頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)l正常細(xì)胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l異常細(xì)胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。當(dāng)前第17頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)BCL2/IGH重排發(fā)生在約80%-85%的FL患者中，檢測BCL2/IGH基因重排可以輔助診斷FL。

BCL2/IGH陰性的FL患者3年生存率為100%，而陽性者只有54%；陰性者3年疾病無進(jìn)展為87.5%，而陽性者只有13%。BCL2/IGH融合基因與濾泡性淋巴瘤

BCL2/IGH融合基因-----輔助診斷濾泡性淋巴瘤

BCL2/IGH融合基因-----判斷預(yù)后當(dāng)前第18頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)l正常細(xì)胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l異常細(xì)胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。當(dāng)前第19頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)結(jié)果判讀-陽性結(jié)果當(dāng)前第20頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)結(jié)果判讀-陽性結(jié)果當(dāng)前第21頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)

約80%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(8；14)（q24;q32）；約15%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(2；8)(p11;q24)；約5%發(fā)生t(8；22)（q24;q11）。

染色體易位導(dǎo)致C-MYC基因斷裂重組可能是伯基特淋巴瘤的一個標(biāo)志，可以應(yīng)用于臨床上伯基特淋巴瘤的輔助診斷。C-MYC基因斷裂與伯基特淋巴瘤輔助診斷伯基特淋巴瘤

當(dāng)前第22頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)當(dāng)前第23頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)結(jié)果判讀-陽性結(jié)果當(dāng)前第24頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)FISH技術(shù)在乳腺癌靶向治療應(yīng)用當(dāng)前第25頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)乳腺癌

Her-2基因

致癌基因：Her-2基因；位點(diǎn)：17q11.2-q12；編碼蛋白：跨膜蛋白（與表皮生長因子受體部分同源）；

25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增；

HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。HER2擴(kuò)增的乳腺癌更具有侵襲性生長能力。當(dāng)前第26頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)乳腺癌Her-2基因及蛋白檢測Cerb-B-2:3+

完全強(qiáng)膜陽性細(xì)胞>30%

2+,1+,-

FISH檢測是否有基因擴(kuò)增當(dāng)前第27頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)Her2基因檢測流程石蠟組織標(biāo)本IHC檢測再用FISH方法檢測—1+3+2+—+Herceptin治療+再用FISH方法檢測Herceptin治療FISH檢測+—再用FISH方法檢測+當(dāng)前第28頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)A.無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號（高度擴(kuò)增）B.顆粒狀信號（R>10，高度擴(kuò)增）C.須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況當(dāng)前第29頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)>30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜高強(qiáng)度著色免疫組化（3+）與FISH對比×40×100浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：+++FISH：呈簇團(tuán)狀高度擴(kuò)增×100當(dāng)前第30頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)免疫組化（－）與FISH擴(kuò)增陽性浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級IHC：－FISH：呈簇狀擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞不著色×40×100當(dāng)前第31頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)基因突變檢測方法當(dāng)前第32頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)3.雜合雙鏈分析法(HA)4.化學(xué)切割錯配(CCM)5.碳化二亞胺檢測(Carbodiimide,CDI)6.酶促切割錯配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)7.單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandConformation)8.切割片段長度多態(tài)性9.DNA測序(Sequencing)10.雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)11.錯配接合蛋白檢測12.蛋白截短測試（proteintruncationtest）方法當(dāng)前第33頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)13.變性的高效液相色譜檢測(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)14.DNA芯片技術(shù)(DNAchip)15.等位基因特異性擴(kuò)增16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(PrimerExtension,PEX)18.寡核苷酸連接檢測(OligonucleotideLigationAssay,OLA)19.限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis）20.突變體富集PCR法（mutant-enrichedPCR）21.蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpionsamplificationrefractorymutationsystem）當(dāng)前第34頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)肺癌組織EGFR基因擴(kuò)增和

突變檢測及其臨床意義當(dāng)前第35頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)研究背景研究顯示吉非替尼對部分晚期NSCLC患者的治療效果非常顯著。存在EGFR基因突變的患者更有可能對吉非替尼的治療敏感。存在EGFR基因擴(kuò)增的肺癌、腸癌病人對分子靶點(diǎn)藥物更為敏感。檢測大腸癌有無EGFR過度表達(dá)，只要>1%的癌細(xì)胞的胞膜強(qiáng)陽性染色即判斷為3+，可作為應(yīng)用西妥昔單抗的指征。當(dāng)前第36頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)

FISH檢測EGFR基因擴(kuò)增標(biāo)本類型：石蠟包埋組織（手術(shù)、活檢、穿刺）冰凍組織胸、腹水沉渣細(xì)胞探針類型：GLPEGFR/CSP7

定量PCR檢測EGFR基因突變分型突變類型：19exon（2235-2249位點(diǎn)）15bp缺失突變

19exon（2240-2257位點(diǎn)）18bp缺失突變

19exon（2240-2251位點(diǎn)）12bp缺失突變

21exon2573位點(diǎn)T>G堿基置換突變

21exon2582位點(diǎn)T>G堿基置換突變

EGFR基因變異檢測當(dāng)前第37頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)當(dāng)前第38頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)雙體性三體性多體性擴(kuò)增EGFR基因FISH檢測狀況肺癌石蠟當(dāng)前第39頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)當(dāng)前第40頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)

FQ-PCR分型技術(shù)檢測EGFR突變當(dāng)前第41頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)存在EGFR突變肺癌樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖71例肺癌組織中檢測出6例突變樣本當(dāng)前第42頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)FQ-PCR檢測15bp缺失陽性病例結(jié)果

紅色閾值線以上的擴(kuò)增曲線即為陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，按熒光信號值的高低依次為9號、12號、13號、55號、38號和33號標(biāo)本

當(dāng)前第43頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)15bp缺失突變型DNA的測序圖

senseantisense當(dāng)前第44頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)紅色閾值線以上的擴(kuò)增曲線即為陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，按熒光信號值的高低依次為2號、36號、和40號標(biāo)本FQ-PCR檢測18bp缺失陽性病例結(jié)果當(dāng)前第45頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)目前K-RAS突變檢測常用技術(shù)當(dāng)前第46頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)方法直接測序焦磷酸測序高分辨率熔解曲線PCR-RFLP芯片雜交Real-TimePCR當(dāng)前第47頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)腫瘤組織的確認(rèn)和篩選顯微切割腫瘤提取DNA相應(yīng)的PCR反應(yīng)或雜交相關(guān)的分析和檢測K-ras突變檢測基本流程圖當(dāng)前第48頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)直接測序(DirectSequencing)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物直接測序雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法)DNA片段是熒光標(biāo)記的，這些片段經(jīng)過平板膠電泳或毛細(xì)管電泳得到分離，熒光分子被激發(fā)而發(fā)光，發(fā)出的光信號被檢測系統(tǒng)檢測當(dāng)前第49頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)當(dāng)前第50頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)K-ras突變檢測結(jié)果當(dāng)前第51頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)療效預(yù)測標(biāo)志物與預(yù)后判斷標(biāo)志物療效預(yù)測標(biāo)志物：

能夠預(yù)測某種特定治療方式療效的標(biāo)記物KRAS基因突變導(dǎo)致腫瘤對EGFR抑制劑抵抗預(yù)后判斷標(biāo)志物：

在不考慮治療因素的情況下能夠判斷患者結(jié)局的標(biāo)記物18號染色體長臂（18q）缺失

某些分子標(biāo)志物兼具兩種作用胸腺嘧啶合成酶（Thymidylatesynthase）當(dāng)前第52頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)EGFR作為預(yù)后因子的價(jià)值EGFRexpressioncorrelateswithpoorprognosisDFS=Disease-freesurvival;OS=overallsurvivalTumortypePrognosisSurvivalRiskofmetastasisReferencesColorectalPoorPoor-DecreasedOSIncreased-Hemming(1992)Mayer,DeJong(1992)Head&Neck(SCCHN)PoorPoorDecreasedDFSDecreasedOS--Grandis(1998)

Maurizi(1996)Lung(NSCLC)PoorPoorDecreasedOS

--

IncreasedOhsaki(2000)

Pavelic(1993)當(dāng)前第53頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)Cetuxamab(西妥昔單抗)人源化嵌合單抗（IgG1）靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）阻斷EGF和TGFα與EGFR的結(jié)合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的腫瘤生長200４年獲得FDA審批資格治療結(jié)直腸癌Panitumumab（帕尼單抗）完全人源化單克隆抗體(IgG2)靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）2005年7月獲得FDA快速通道審批資格治療結(jié)直腸癌結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物

當(dāng)前第54頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)KRAS突變KRAS突變可不依賴EGFR受體途徑，自行激活RAS/MAPK通路導(dǎo)致ERBITUX耐藥KRAS突變與Erbitux療效及患者生存相關(guān)KRAS突變并非孤立事件KRAS突變常伴隨BRAF突變，并與CpG島甲基化表型(CIMP)1,2相關(guān)KRAS突變常伴隨PI3K突變3

LièvreA,etal.JClinOncol2008;26:374–379MAPK=mitogen-activatedproteinkinase當(dāng)前第55頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)K-ras基因野生型患者能從這類藥物治療中獲益。K-ras基因突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應(yīng)危險(xiǎn)和治療費(fèi)用；抗EGFR治療和K-ras突變相互排斥K-ras基因抗EGFR治療關(guān)系密切當(dāng)前第56頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)2009年7月FDA批準(zhǔn)了對西妥昔單抗和帕尼單抗說明書標(biāo)簽的修改：

結(jié)直腸癌分子靶向治療藥物

注明KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者不推薦這使用這兩種用藥物。

當(dāng)前第57頁\共有64頁\編于星期一\14點(diǎn)

K-ras基因突變:20-60%結(jié)直腸癌

K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K