桿狀病毒轉導的小鼠羊水干細胞保持成骨分化潛能的實驗研究

桿狀病毒轉導的小鼠羊水干細胞保持成骨分化潛能的實驗研究【摘要】目的探討帶有綠色熒光蛋白基因的重組桿狀病毒修飾后的小鼠羊水干細胞(mouseamnioticfluidstemcells,mAFSs)是否仍保持成骨分化潛能。方法體外原代培養(yǎng)小鼠羊水干細胞，并進行成脂成骨誘導分化，鑒定多向分化潛能；體外構建并擴增重組桿狀病毒；Bv-GFP體外轉導小鼠羊水干細胞，流式細胞儀檢測其轉導效率；經Bv-GFP基因修飾后的小鼠羊水干細胞進行成骨誘導分化。結果小鼠羊水干細胞體外具有良好的增殖能力，3代后的細胞呈現(xiàn)較均一的梭形、漩渦狀生長，且小鼠羊水干細胞體外具有成脂成骨分化潛能。體外成功構建重組桿狀病毒，經Sf9細胞擴增后，極度稀釋法測定其滴度可達/ml；Bv-GFP體外可較有效轉導小鼠羊水干細胞，其轉導效率為％，且經Bv-GFP基因修飾后的小鼠羊水干細胞仍保持成骨分化潛能。結論小鼠羊水來源干細胞是一種理想的干細胞，桿狀病毒是一種新型病毒基因載體，體外能較有效轉導小鼠羊水干細胞且不改變其成骨分化潛能。經重組桿狀病毒基因修飾的羊水干細胞會為今后的骨組織工程提供一種新的治療模式。

【關鍵詞】桿狀病毒羊水細胞基因修飾成骨分化

【Abstract】ObjectiveToexplorewhetherthemouseamnioticfluidstemcells(mAFSs)maintainthepotentialofosteogenesisdifferentiationaftergenemodificationbygreenfluorescentprotein(GFP)labeledbaculovirus.MethodsmAFSswereprimaryculturedinvitroandwereinducedforosteogenicandadipogenicdifferentiation,themulti-directionaldifferentiationwasidentified.Baculovirus-CMV-GFP(Bv-GFP)wasconstructedandamplified,thenitwastransfectedtomAFSs,thetransfectionefficiencywastestedbyflowcytometer;osteogenicdifferentiationwasinducedonthetransfectedstemcells.ResultsThemAFSshadgoodproliferationcapacity,cellswerehomogeneouslyspindle-shapedafter3generationsandgrewinwhirlpoolmanner,alsotheyhadosteogenicandadipogenicdifferentiationpotential.Thereconstructedbaculoviruswassuccessfullyconstructed,afterSf9amplification,thetilterwas/mlafterextremedilutionmethod；Bv-GFPcouldeffectivelytransfectedmAFSs,withthetransfectingrateat%,andremainedosteogenicanddifferentiationpotentialaftergenemodification.ConclusionsmAFSsareidealstemcells,baculovirusisanewtypeofviralgeneticvector,whichcaneffectivelytransfectmAFSswithoutchangingtheosteogenicdifferentiationpotential.MAFSs,aftergeneticallymodifiedbyreconstructedbaculovirus,providesanewtreatingmodeforbonetissueengineering.

【Keywords】BaculovirusAmnioticfluidstemcellGenemodificationDifferentiationofosteogenesis外傷或手術時造成的骨損傷如不能自行修復，則會造成骨不愈合或骨缺損,常需自體或異體骨移植，但其效果并不確切,不但增加了病人的痛苦和經濟負擔，同時又存在許多并發(fā)癥［1］。若在骨損傷的部位注入有成骨潛能的細胞并誘導其成骨分化，可能解決這一問題［1，2］。干細胞的發(fā)現(xiàn)和深入研究為這個設想帶來了希望。干細胞是具有自我復制和多向分化潛能的一類細胞，一般分為胚胎干細胞和成體干細胞。常見的成體干細胞如骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、臍血干細胞等，雖然大量的研究證實它們可以于體內外成骨分化［2］，但取材較困難，且成骨分化潛能較低［2，3］；胚胎干細胞雖然具有較好地成骨分化潛能，但因其受倫理道德的限制及體內具有致瘤可能性，應用受限［4，5］。最近的大量研究表明，羊水中亦存在干細胞，在體內外具有很好的增殖能力［6～8］，它具有胚胎干細胞的特性，如表達SSEA、OCT-4等胚胎干細胞表面標志［6～9］，同時羊水干細胞于體內外都具有較好的成骨分化潛能［6～8］，且其取材容易，無倫理道德限制，故對于骨組織的修復研究來說，羊水干細胞是一種理想的種子細胞［10］。然而，干細胞在體內成骨分化受到多種因素的影響［11］，若在體外對干細胞進行基因修飾，將會顯著提高其在體內的成骨分化潛能［11］。目前，常用的基因載體如腺病毒載體、慢病毒載體、質粒載體有諸多缺陷而限制了的臨床應用［12］。而桿狀病毒包裝載體容量大，對靶細胞無毒性作用，無致瘤性等優(yōu)點［13］，是一種理想的病毒基因載體，但重組桿狀病毒是否可有效轉導羊水干細胞，以及轉導后的羊水干細胞是否保持成骨分化潛能，目前國內外還沒有相關報道。本研究旨在探討體外Bv-GFP是否可有效轉導小鼠羊水干細胞，以及對其成骨分化是否有影響，為今后的桿狀病毒載體基因修飾羊水干細胞及運用于今后的骨組織重建工程研究奠定基礎。

1材料和方法

主要試劑及器材低糖DMEM培養(yǎng)基、Grace培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)、馬血清、無鈣鎂PBS、堿性成纖維細胞生長因子，均購于美國Gibco公司；維生素C、β-磷酸甘油，購于美國Sigma公司，培養(yǎng)瓶、離心試管及培養(yǎng)皿，購于美國Corning公司；倒置熒光顯微鏡為日本Olympus產品，流式細胞儀為美國BD公司產品。

實驗過程將2月齡昆明小鼠雌雄合籠，如第2天發(fā)現(xiàn)雌鼠陰部有白栓，即開始計時。取孕12d的小鼠，在水合氯醛麻醉下，剖開腹部，用微量定量注射器在羊膜內取左右的羊水，注入的培養(yǎng)皿中,并加入含有10%FBS、10ngml-1bFGF、100Uml-1青霉素和100μgml-1鏈霉素的2ml低糖DMEM沖懸混勻。2d后換液，可見有梭形貼壁細胞出現(xiàn)。12d左右后，培養(yǎng)皿中貼壁的梭形細胞可長至80％以上。吸去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍之后，加％的胰酶消化，以1∶2傳代并細胞計數(shù)。以后每2d換一次液，細胞長至90％時，以1∶3傳代。(2)P5代小鼠羊水干細胞傳于培養(yǎng)皿中，待其長至80％以后，吸去完全培養(yǎng)基，用PBS洗2遍之后加入2ml成脂、成骨誘導液。成脂誘導液：低糖DMEM加入終濃度為10％胎牛血清、50μg/ml維生素C、10-7mmol/L地塞米松、50μg/ml吲哚美辛。成骨誘導液：低糖DMEM加入終濃度為10％胎牛血清、50μg/ml維生素C、10-8mmol/L地塞米松、10mM/Lβ-磷酸甘油。mAFDSCs經成脂或成骨誘導液誘導之后，每3d換一次誘導液。2周后吸去成脂或成骨誘導液，PBS洗2遍之后用4％多聚甲醛固定。用油紅O對成脂誘導細胞染色，鑒定其成脂分化；用茜素紅對成骨誘導細胞染色，鑒定其成骨分化。重組桿狀病毒構建，擴增及滴度測定。運用Bac-to-Bac操作系統(tǒng)成功構建Bv-GFP，經Sf9昆蟲細胞擴增后，用極度稀釋法進一步測其擴增后的病毒滴度。當25cm2細胞培養(yǎng)瓶內sf9細胞長至80％時，加入1mlBv-GFP病毒原液，并加入1mlPBS混勻后置于37℃冰箱孵育1h，之后倒掉病毒液，PBS洗2遍之后加入Grace完全培養(yǎng)基，2d后用胰酶消化細胞并離心，倒掉培養(yǎng)基后PBS洗2遍，之后PBS重懸sf9細胞并于液氮反復凍融3次后離心，緩慢吸出病毒上清液并以1∶3的比例感染sf9細胞，最后擴增至20瓶75cm2培養(yǎng)瓶。反復凍融細胞收病毒，收集的病毒懸液于27000g離心3h，PBS重懸過夜，利用極度稀釋法測定收集到的Bv-GFP的滴度。P6代小鼠羊水干細胞種植于培養(yǎng)皿中，待其長至80％時，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍之后進行桿狀病毒轉導。依據(jù)培養(yǎng)皿中的細胞數(shù)，調整桿狀病毒劑量，使感染指數(shù)為/cell，并加入500μlPBS沖懸混勻病毒，將皿至于細胞培養(yǎng)箱孵育4h。4h之后吸去PBS，加完全培養(yǎng)基于皿，并放置于37℃細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。桿狀病毒轉導后的小鼠羊水干細胞置于倒置熒光顯微鏡下,采用藍光激發(fā)觀察，發(fā)綠光的細胞定為陽性細胞。桿狀病毒轉導3d后的小鼠羊水干細胞用PBS洗2遍，％胰酶消化，移至離心管于1500r/min離心5min,用500μlPBS重新懸浮，并吹散為單細胞懸液后使用流式細胞儀檢測桿狀病毒轉導效率。每個細胞樣品約×105個細胞，以未經桿狀病毒載體轉導的細胞作為對照。經Bv-GFP轉導后的小鼠羊水干細胞進行成骨誘導分化，以未經病毒轉導的羊水干細胞作為對照，方法同上。

2實驗結果

小鼠羊水干細胞形態(tài)及其生長方式見圖1。

羊水干細胞成脂成骨羊水干細胞成脂見圖2，羊水干細胞成骨見圖3。

圖1P5代小鼠羊水干細胞圖2成脂誘導分化圖3成骨誘導分化

桿狀病毒擴增、滴度測定Bv-GFP經sf9細胞擴增后，極度稀釋法測定其滴度為/ml。

桿狀病毒轉導倒置熒光顯微鏡攝像見圖4。

流式檢測見圖5、6。

圖4

圖5陰性對照

圖6Bv-GFP轉導效率52％

對照組細胞誘導成骨、病毒轉導組細胞誘導成見見圖7、8。兩組細胞成骨能力無明顯差別，說明經桿狀病毒基因載體轉導后的小鼠羊水干細胞成骨分化潛能不變。

圖7對照組細胞誘導成骨圖8病毒轉導組細胞誘導成骨

3討論

羊水干細胞是從孕中期母體子宮羊水中提取出來的一類具有胚胎干細胞增殖分化特征的干細胞，有別于胚胎干細胞，又較成體干細胞有更大的分化潛能［3］，可分化成3個胚層的細胞且在體內不形成畸胎瘤［6，7］。2007年由美國科學家發(fā)現(xiàn)并將其命名為羊水干細胞(amnioticfluidstemcells,AFSCs)［6］。本實驗成功從小鼠的羊水中培養(yǎng)出了干細胞，并在體外進行了的誘導分化成脂成骨，證實了羊水中存在有干細胞，且其有良好的增殖和分化潛能，是一種理想的組織工程種子細胞。

應用各種載體，如質粒、腺病毒、逆轉錄病毒，對干細胞進行體外基因修飾，增強其成骨分化潛能是骨組織重建工程研究的一個新方向，增強了干細胞應用于的骨組織修復臨床的應用前景［14～18］。桿狀病毒是一個新型的基因轉導載體，以節(jié)肢動物為唯一宿主,可進入哺乳動物細胞但不被復制，也不和先前存在的病毒基因重組，在哺乳動物體內桿狀病毒載體有極小的細胞毒性，它可容納下30kb的DNA片段，單一的載體可轉運大功能的基因或多基因，且具有高水平的轉導率，載體相對容易構建和病毒生產有效滴度較高等優(yōu)點［13］，可以被廣泛應用于體內及體外［19，20］，是一種很有希望的基因載體。本實驗成功地應用帶綠色熒光蛋白的重組桿狀病毒從體外轉入小鼠的羊水干細胞，達到約52%的轉導率，證實了重組桿狀病毒能有效地轉導羊水干細胞，且發(fā)現(xiàn)其轉導后對小鼠羊水干細胞誘導分化成骨的潛能并無影響，為進一步應用帶基因的重組桿狀病毒體外轉導羊水干細胞、促進其在體內的定向誘導分化成骨潛能奠定了基礎。羊水干細胞及桿狀病毒有著較前各類干細胞和病毒載體所不可比擬的優(yōu)點，所以可以想象，重組桿狀病毒基因修飾羊水干細胞誘導成骨這一新的病毒載體基因修飾的干細胞，對修復骨損傷模式將會有更好的臨床應用前景。

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