核糖體DNA-ITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用

核糖體DNAITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用【摘要】藥用植物核rDNA是高度重復(fù)的串聯(lián)序列，由于同步進(jìn)化的力量，大多數(shù)物種中這些重復(fù)單位間已發(fā)生純合或接近純合。把核rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分為ITS1和ITS2兩部分。由于ITS序列變異較快，能夠提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，已在藥用植物鑒別、道地性研究、栽培與野生藥用植物遺傳差異分析、較低分類階元的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】核糖體DNAITS區(qū)藥用植物

Abstract：NuclearrDNAinthemedicinalplantsisatandemsequenceofhighlyrepeatableunitswhichbecomehomogenizedornearlyhomogenizedinmostspecies.TheinternaltranscribedspacersofnuclearrDNAwasdividedintoITS1andITS2byrDNA.Asmutatequickly,ITSsequencesarecapableofprovidingmanyvariablesitesandinformativesites,whichplaysmoreandmoreimportantrolesintheauthenticationsofmedicinalherbs,studiesonthegenuineness,geneticvariationanalysisbetweencultivatedandwildmedicineplants,systematicdevelopmentandclassificationresearchesonthelowertaxonofthemedicinalplants.

Keywords：NuclearrDNA;ITSsequence;Medicinalplants

人們對藥用植物的研究有著悠久的歷史。隨著植物遺傳學(xué)規(guī)律的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，植物大量次生代謝產(chǎn)物的分離與結(jié)果鑒定及其對系統(tǒng)學(xué)意義的探討，進(jìn)一步加深了人們對藥用植物的認(rèn)識。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，使以形態(tài)組織學(xué)、解剖學(xué)等客觀指標(biāo)為劃分依據(jù)的傳統(tǒng)分類學(xué)得到了補(bǔ)充，為藥用植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究提供了豐富而翔實(shí)的資料，為解決分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、物種形成與進(jìn)化等方面的難題提供了極為有力的技術(shù)途徑［1］。中藥用于疾病防治已有幾千年的歷史，但由于中藥現(xiàn)代品質(zhì)監(jiān)控技術(shù)不足，常常出現(xiàn)藥材混淆代用、故意偽制的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響中藥的聲譽(yù)，甚至危及人身安全，建立健全完善的中藥品質(zhì)檢測技術(shù)體系迫在眉睫。目前，越來越多的研究者將ITS應(yīng)用于藥用植物的鑒別，為揭示藥用植物的遺傳差異和鑒定中藥材品種的道地性提供了新的方法和手段［2］。本文著重對核糖體DNAITS序列分析在藥用植物的鑒定、道地性研究、栽培與野生藥用植物遺傳差異分析及藥用植物科以下等級系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

118S-26SrRNA基因的基本結(jié)構(gòu)

目前，核基因組序列在藥用植物鑒定和品質(zhì)研究中的應(yīng)用主要集中在編碼核糖體RNA基因nrDNA重復(fù)區(qū)內(nèi)。高等植物細(xì)胞核中nrDNA是高等植物中的rRNA基因(rDNA)是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，18S，和26SrDNA聯(lián)結(jié)在一起，作為一個轉(zhuǎn)錄單位。18S-26SrDNA在植物中有一至數(shù)個位點(diǎn)［3］，拷貝數(shù)可達(dá)500～40000，18S-26SrDNA基本結(jié)構(gòu)由18SrDNA，26SrDNA，rDNA和位于三者之間的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)組成，其中ITS區(qū)由被rDNA所分隔的ITS1和ITS2兩個片段組成［4］。其轉(zhuǎn)錄物(transcript)不加入成熟核糖體，只是部分地對nrDNA的成熟起作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者已利用nrDNA中的ITS片段序列作為分子標(biāo)記，在藥用植物鑒定和品質(zhì)研究方面開展了許多有益的工作。

l8S-26S核rDNAITS區(qū)在核基因組中高度重復(fù)，而且通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換，這些重復(fù)單位間已經(jīng)發(fā)生了位點(diǎn)內(nèi)和位點(diǎn)間的同步進(jìn)化，即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致，且所受選擇壓力較小，堿基替換速率較快，進(jìn)化速度快，加上片段長度變異很小，ITS1和ITS2的長度均不足300bp，在絕大多數(shù)被子植物中不足700bp，非常適合進(jìn)行各種分子操作［5］。屈良鴿等通過對不同生物類群的ITS序列(自生物學(xué)數(shù)據(jù)庫)的比較得出：被子植物大多數(shù)科屬其ITS序列的種間差異值為％～％，屬間差異值為％～％，這對系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較合適的范圍。另外，ITS在一些起源古老或世代較長的植物類群(如木本竹子)中的變異較低，也為研究那些間隔區(qū)進(jìn)化速度很慢的古老類群間的關(guān)系和長世代類群內(nèi)較高階元的系統(tǒng)重建提供了可能性［6］。

2ITS區(qū)測序的技術(shù)流程及系統(tǒng)學(xué)分析

目前研究者對ITS序列分析的具體流程大體相同，主要包括總DNA提取、PCR擴(kuò)增、、測序、排序等步驟。

總DNA的提取采用CTAB法或在此基礎(chǔ)上略加改良，從新鮮葉片、鮮莖、甚至保存數(shù)年的蠟葉標(biāo)本中提取總DNA。在野外，可先用硅膠干燥法保存材料，然后帶回實(shí)驗(yàn)室提取總DNA。所提取DNA的純度是影響測序準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。

PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及測序選擇合適的引物對ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，然后經(jīng)瓊脂糖電泳檢測、回收、純化。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化是直接測序的關(guān)鍵，可用離心透析法、透析袋法等。也可先對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，然后測一個或者多個序列。Baldwin［7］曾指出，在被子植物系統(tǒng)發(fā)育分析中，是測定ITS區(qū)PCR克隆，還是直接測定PCR全部產(chǎn)物的序列更好，尚處于爭論之中。常用的測序儀有：PE公司的ABI3l0，ABI377自動測序儀、LKBDNA測序儀等。

排序用手工或計(jì)算機(jī)軟件如CLUSTALV、CLUSTALX、CLUSTALW、DNASTAR程序等對所測得的序列進(jìn)行排序，然后根據(jù)空位(gap)情況對排序結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。ITS1和ITS2的范圍可根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的植物18S、和26SrDNA序列以及近緣類群的ITS1、ITS2序列確定。

系統(tǒng)學(xué)分析對已排好的序列進(jìn)行變異位點(diǎn)(variablesite)和信息位點(diǎn)(informativesite)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，然后進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，只有信息位點(diǎn)才能用于系統(tǒng)學(xué)分支分析。常用的分析軟件有PAUP分析軟件、PHYIIP3軟件包、MEGA等。對轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)進(jìn)行加權(quán)和對于將gap作為缺失(missing)或新性狀(newstate)得到的簡約樹樹形大致相同，但自展數(shù)值(bootstrap)不同。最常用的分支分析法有簡約法(parsimonymethod)、鄰接法(neighbor-joiningdistancemethod)、最大似然法(maximumlikelihoodmethod)等。

3rDNAITS序列分析在藥用植物鑒定中的應(yīng)用

資源調(diào)查表明，我國中草藥約有萬余種，其中藥用植物約占85％，對它們進(jìn)行明確的鑒別是非常重要的。中藥材的準(zhǔn)確鑒定是中藥研究和實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的基礎(chǔ)。由于我國藥用植物種類繁多，藥材來源復(fù)雜，在藥材使用上存在互混、互代、以假充真等及同名異物、同物異名現(xiàn)象，因而影響了用藥的安全性和有效性。應(yīng)用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)成分來鑒定比較困難，通過比較分析ITS區(qū)序列，可以很容易地鑒別其真?zhèn)危?］。

中藥南五味子為華中五味子的干燥果實(shí)。綠葉五味子的化學(xué)成分與南五味子有所不同，但果實(shí)外形相似，使市場上南五味子藥材真?zhèn)坞y辨。高建平等［9］通過比較采自湖南、四川、陜西、河南、山西、浙江等的12個自然居群的華中五味子和綠葉五味子rDNAITS區(qū)的DNA序列的差異及其規(guī)律性，得出rDNAITS區(qū)為鑒別中藥南五味子與混淆品綠葉五味子的一種良好的分子標(biāo)記。

柴胡是一種多來源藥材，在我國的使用已有兩千多年的歷史。柴胡具有和解表里、疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣之功效。用于治療感冒發(fā)熱、口苦耳聾、頭痛目眩等癥。目前，在中國報道的柴胡屬植物有42種，17變種，7變型。謝暉等［10］和武瑩等［11］的研究均發(fā)現(xiàn)：ITS序列可以作為柴胡類藥材鑒定的依據(jù)。

此外，Wen等［12］對人參屬12種植物的ITS區(qū)和進(jìn)行了序列分析和有效鑒別，發(fā)現(xiàn)西洋參與東亞種人參、竹節(jié)參、三七具有更近的親緣關(guān)系。Ngan等［13］以保守的植物序列作引物，對ITS區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增，并籍以鑒定人參屬6種藥用植物。蔣繼宏等［14］研究蘇皖產(chǎn)大戟屬內(nèi)6種藥用植物的ITS區(qū)，其結(jié)果與來自形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果相吻合，從而得出ITS區(qū)可用于大戟屬植物種間及真?zhèn)纹疯b別。郝明干等［15］通過ITS的序列比較，將白花蛇舌草與外形上與其相似的纖花耳草、傘房花耳草和松葉耳草區(qū)別開來。劉忠權(quán)等［16］收集目前市場上出現(xiàn)的白花蛇舌草及偽品共9種，通過對其ITS2區(qū)的序列的分析，將白花蛇舌草及偽品區(qū)分開來。金成庸等［17］為研究韓茵陳和白蓮蒿是否為同一植物，同時對來源于兩個不同國家的3種茵陳的rDNAITS序列進(jìn)行遺傳差異的探討，認(rèn)為用rDNA的ITS序列分析法鑒別茵陳類藥材，方法簡便、準(zhǔn)確。彭雪梅等［18］通過對羅布麻及其易混品的DNA分子鑒定，可以將羅布麻同其混淆品大白葉麻和區(qū)分開來。丁平等［19］比較巴戟天與常見混偽品之間的rDNAITS區(qū)堿基序列的差異及其規(guī)律，得出ITS序列可作為巴戟天與混偽品的一種較好的分子指紋圖譜的標(biāo)記方法。

4rDNAITS序列分析在藥用植物科以下等級系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的應(yīng)用價值

ITS區(qū)序列分析已成為在分子水平上探討科、亞科、族內(nèi)關(guān)系十分有效的手段，在植物系統(tǒng)發(fā)育與分類的研究中起了重要作用。

科內(nèi)系統(tǒng)與進(jìn)化劉艷玲等［20］基于核糖體DNAITS區(qū)序列探討了睡蓮科植物7屬11種的系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，結(jié)果表明，①蓮屬Nelumbo可從睡蓮科中獨(dú)立出來成立蓮科Nelumbonaceae和蓮目Nelumbonales；②萍蓬草屬仍應(yīng)置于睡蓮科中；③水盾草屬Cabomba和莼菜屬Brasenia聚成一小支并構(gòu)成姐妹群，說明這兩屬之間親緣關(guān)系較近；④睡蓮屬和芡實(shí)屬Euryale、王蓮屬Victoria聚成一小支并構(gòu)成姐妹群，說明三者親緣關(guān)系較近，仍應(yīng)置于睡蓮科中。此外，nrDNAITS序列分析用于槭樹科、菖蒲科、檉柳科、金縷梅亞科、君子科風(fēng)車子亞科、金縷梅科殼菜果亞科等科的系統(tǒng)發(fā)育研究中取得了很好的結(jié)果。

屬內(nèi)系統(tǒng)與進(jìn)化關(guān)系密切的物種間ITS長度接近，而序列有一定程度的變異，因此，該片段特別適合于屬，尤其是近緣屬間關(guān)系等低級分類群的研究［21］。

Kita和Ito［22］利用ITS序列對產(chǎn)于東亞的烏頭亞屬一些二倍體種與四倍體種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。Utelli等［23］為了解釋產(chǎn)于歐洲的黃花牛扁復(fù)合體的系統(tǒng)關(guān)系，測定了產(chǎn)于歐洲與高加索山脈的所有牛扁亞屬的種與產(chǎn)于歐洲的烏頭亞屬的種的nrDNAITS序列及cpDNA的psbA-tmH序列，并運(yùn)用簡約性方法，進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。張富民等［24］對烏頭屬Aconitum個類群的nrDNAITS序列進(jìn)行了簡約法與鄰接法分析，結(jié)果表明，紫烏頭復(fù)合體不是一個單系類群，可能經(jīng)歷了3次不同的起源。這三項(xiàng)研究顯示，ITS序列數(shù)據(jù)均為烏頭屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究提供了有意義的信息。

趙國平等［25］測定中日當(dāng)歸屬21份材料藥用植物的ITS區(qū)序列，經(jīng)Phylip軟件分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果與當(dāng)歸屬藥用植物功效差異基本吻合。汪紅等［26］研究中藥丹參ITS片段遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)該序列在丹參種內(nèi)保守，在屬間有較大的差異，與外類群的差異最大。蔣繼宏等［27］研究蘇皖產(chǎn)大戟屬內(nèi)6種藥用植物的ITS長度的變異，聚類所得系統(tǒng)進(jìn)化樹與形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果相吻合，為探討大戟屬植物的系統(tǒng)演化關(guān)系和大戟屬植物鑒定提供DNA分子證據(jù)。閆坤等［28］對地黃屬6個物種進(jìn)行了核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為，地黃屬為單系起源，天目地黃與湖北地黃有較近的親緣關(guān)系；高地黃和裂葉地黃應(yīng)為同一物種；地黃與茄葉地黃是屬內(nèi)進(jìn)化水平最高的類群。

種內(nèi)系統(tǒng)與進(jìn)化由于nrDNA的ITS區(qū)域具較多的堿基變異信息，在長度上具較好的保守性，因而近十幾年來被廣泛地用于生藥的種間鑒別［29］。曹暉等［30］還認(rèn)為可將ITS區(qū)用于種下一級分類群親緣關(guān)系研究。

羅玉明等［31］分析紫蘇屬各變種間(紫蘇、白蘇、雞冠蘇和耳齒紫蘇等)rDNAITS區(qū)的序列以及存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)現(xiàn)象，設(shè)計(jì)出位點(diǎn)特異性PCR引物，用于紫蘇屬各變種間的分子標(biāo)記鑒別。吳玲等［32］利用ITS序列對石蒜屬13個種(含變種)的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，表明石蒜屬13個種可分為三大類，比較系統(tǒng)進(jìn)化樹和核型分析，推導(dǎo)出稻草石蒜、乳白石蒜和短蕊石蒜為變種。

5應(yīng)用rDNAITS序列探討藥用植物道地性

中藥的品質(zhì)關(guān)系到臨床用藥的安全有效，發(fā)展道地藥材是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。藥材道地性主要是指藥材中有效成分的地域差異性，品質(zhì)優(yōu)良是道地藥材的表現(xiàn)型。藥材道地性研究是藥學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，主要包括兩個方面：一是研究形成藥材道地性的重要原因；二是如何鑒別藥材市場上的道地性藥材。藥用植物道地性的形成與其代謝過程中的酶系統(tǒng)發(fā)生的“道地性”變化有密切聯(lián)系，但這種變化受其居群的遺傳特性和生態(tài)環(huán)境的影響。目前，關(guān)于藥用植物品質(zhì)的研究多限于形態(tài)、化學(xué)藥效學(xué)方面，但道地性藥材與非道地性藥材在形態(tài)和生藥性狀等特征上的差別常不明顯，這給應(yīng)用傳統(tǒng)方法鑒別道地藥材帶來了困難［33］。DNA分子作為遺傳信息的載體，不受材料的生長環(huán)境及發(fā)育時期等的影響，通過rDNAITS序列分析，找到不同樣本間在DNA水平上的遺傳差異，對藥材地理分布和分化變異進(jìn)行評判與劃分，不僅使從分子水平上來揭示藥材道地性形成的原因成為可能，而且使道地藥材的鑒定更為便利、準(zhǔn)確。如果同時結(jié)合藥效成分分析，對于道地藥材的品質(zhì)評價能起到指導(dǎo)性作用［34］。

為研究蓮的種質(zhì)資源道地性的鑒定、為其質(zhì)量控制和蓮的GAP實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)，林珊等［35］和唐先華等［36］分別從分子水平上比較了不同地區(qū)蓮的差異，結(jié)果表明不同地區(qū)蓮的ITS區(qū)序列有一定的差異，蓮樣品的ITS區(qū)序列即其ITS及的序列分析資料可為蓮的品種鑒別及分類提供新的手段。半夏為天南星科半夏屬植物，其干燥塊莖為我國傳統(tǒng)大宗藥材。張君毅等［37］對來自我國半夏主要的16個居群18個樣本rDNA中的ITS區(qū)序列進(jìn)行分析，得出半夏rDNA變異與其地理分布相關(guān)。馬玉花等［38］對l5個來自不同地區(qū)杜仲品系rDNA的ITS序列分析，為分布于我國同地區(qū)杜仲的分類鑒別提供分子生物學(xué)依據(jù)。王淑美等［39］探討不同產(chǎn)地牛膝的ITS的序列變異，得出牛膝與川牛膝及土牛膝堿基序列有明顯差異，不同產(chǎn)地、不同栽培品種牛膝堿基序列無差異。

目前，應(yīng)用DNA序列分析方法探討藥用植物道地性的研究雖然才剛起步，但是將來自不同居群藥材的化學(xué)成分和其DNA序列分析相結(jié)合則可以為藥用植物道地性的研究提供

由于生態(tài)環(huán)境的改變等因素，生物的遺傳特性及其生藥品質(zhì)在一定程度上發(fā)生了變化，產(chǎn)地和栽培對生藥品質(zhì)及藥性產(chǎn)生巨大影響。在人類回歸自然的今天，在野生種比栽培種品質(zhì)更好的觀念指導(dǎo)下加之經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動，以栽培種冒充野生種，給藥材流通造成混亂，ITS區(qū)在其識別方面有其良好的應(yīng)用前景［40］。

馬小軍等通過RAPD指紋比較研究發(fā)現(xiàn)，野山參與栽培參之間存在較大的遺傳變異。為了搞清野生人參與栽培人參之間的遺傳變異程度，馬小軍等［41］對4個野山參的ITS和2個野山參的ITS進(jìn)行了測序分析，并對照栽培人參和西洋參L.的ITS基因序列，研究野生人參與栽培人參之間以及兩者與近緣種西洋參之間的遺傳關(guān)系。結(jié)果表明，黑龍江和朝鮮栽培參的種探與撫橙的野山參較近，而湖北栽培參(U41681)可能從引自其它野山參居群。ITS的遺傳信息有助于人參種質(zhì)資源分析，能為栽培參起源提供一定證據(jù)。保曙琳等［42］對野生菱和栽培菱種rDNAITS片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)盡管菱屬各居群間rDNAITS的差異百分率較小，其親緣關(guān)系較近，但根據(jù)ITS序列的特征可以很好地鑒別野生菱、栽培菱，菱屬植物有可能都起源于同一種野生類居群。戴波等［43］對不同倍性及其非整倍體韭和野韭核糖體DNAITS進(jìn)行了分析，得出雖然韭經(jīng)歷了長期的人工選擇和自然選擇，但與野韭的分化仍然較小。李建強(qiáng)等［44］對山毛櫸科水青岡屬6種、1亞種、1栽培變種的ITS區(qū)片段進(jìn)行了測序和分析，發(fā)現(xiàn)各類群間ITS區(qū)序列差異較小，顯示屬內(nèi)現(xiàn)存物種的分化時間不是太長。

7前景與展望

隨著DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展，rDNAITS序列分析已經(jīng)應(yīng)用到了中藥的基原鑒定、道地性研究等多個領(lǐng)域，在生藥鑒別方面也已進(jìn)行了許多開拓性的研究［45］。雖然DNA序列分析技術(shù)操作復(fù)雜、成本高，在實(shí)際應(yīng)用中仍存在很大的困難，目前還不能成為一種常用的鑒別手段，但卻為從DNA水平上尋找藥用植物鑒定和道地藥材鑒別的可靠的特異性DNA分子標(biāo)記提供了有益的啟示。

道地藥材是指那些來源于特定產(chǎn)區(qū)的具有中國特色的名優(yōu)正品藥材，它們在遺傳和生態(tài)兩種因素長期復(fù)雜的相互作用下，形成了特有的品種和藥性。但由于道地藥材和非道地藥材物種來源相似，在形態(tài)、藥性、化學(xué)成分等特征上具有高度的一致性，對道地藥材的鑒定很困難［46］。利用rDNAITS區(qū)雖已經(jīng)取得了一些進(jìn)展但還缺乏整體、全面的資料，因此應(yīng)選擇一些具有道地性且名貴的中藥，如人參、地黃、川貝等，構(gòu)建其DNA文庫，并對其DNA文庫進(jìn)行大量分析，篩選出有用蛋白基因，進(jìn)而克隆這些基因，建立我國自己的基因儲備。同時進(jìn)一步對這些藥材進(jìn)行遺傳分子標(biāo)記研究，找出其道地性即藥用植物多樣性的遺傳分子基礎(chǔ)。對同一物種在不同環(huán)境下形成的道地性與非道地性進(jìn)行深入的遺傳學(xué)研究，闡明其道地性的規(guī)律，建立完善的道地性評價的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和天然藥物化學(xué)指標(biāo)體系。

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