免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細胞的影響

免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細胞的影響【摘要】目的研究免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細胞(Macrophage，M)的損傷作用機制。方法以小鼠腹腔巨噬細胞為對象，采用小鼠尾靜脈注射地塞米松/只，環(huán)磷酰胺/只，小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)，檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能及腹腔灌洗液中NO2-/NO3-濃度并用形態(tài)學(xué)方法觀察比較免疫抑制劑對小鼠腹腔巨噬細胞的損傷特點。結(jié)果地塞米松和環(huán)磷酰胺均能抑制巨噬細胞功能，與對照組比，細胞吞噬功能均顯著下降，DEX組腹腔灌洗液中NO2-/NO3-濃度顯著升高，Cy組不升高。VitC為自由基鏈反應(yīng)阻斷劑，阻斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可減輕損傷，可使DEX組細胞吞噬功能獲得部分恢復(fù)。結(jié)論推測環(huán)磷酰胺對腹腔巨噬細胞損傷是以直接損傷染色體而DEX以氧化損傷為主。

【關(guān)鍵詞】地塞米松環(huán)磷酰胺巨噬細胞

Theeffectofdexamethasoneandcyclphosphamideonperitonealmacrophageofmice

【Abstract】ObjectiveWeinvestigateddemagemechanismofperitonealmacrophage(M)inducedbyinjectionofdexamethasoneandcyclophosphamideinTheimmunefunctionbydeterminingthephagocyticfunctionandstructureofthemacrophagocytesoftheabdominalcavitiesofmiceinvitro.Thephagocytosisofperitonealmacrophageswasevaluatedbychickenerythrocytesmethod;ObservedtheconcentratuonofNO-2/NO-3intheperitoneallavageDexamethasoneandcyclophosphamideinducedtheapoptosisofperitonealmacrophageandconcomitantdecreaseofphagocytosis(vscontrolgroup，)，theconcentratuonofNO-2/NO-3intheperitoneallavagefluidsignificantlyincreasedafterdexamethasoneinjection;VitC(inhibitorofiNOSandinhibitorofreactiveoxygenspecies)preventedtheapoptosisofperitonealmacrophageandreducedtheconcentrationofNO-2/NO-3intheperitoneallavagefluidaftertheeffectofTheseevidencessupportthatNOandactiveoxygenspeciesmaybeinvolvedintheapoptosisprocessofperitonealperitonealmacrophageinducedbydexamethasoneinmice.

【Keywords】dexamethasonecyclophosphamidemacrophage

地塞米松和環(huán)磷酰胺在臨床腫瘤的治療中是常用的藥物，在殺傷腫瘤細胞的同時又會引起免疫系統(tǒng)損傷，而影響治療效果。巨噬細胞(macrophage，M)是機體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細胞，具有非特異性直接清除各種異物，殺傷病原體和腫瘤細胞的功能，并具有抗原提呈作用。本實驗選用小鼠腹腔巨噬細胞進一步探討在整體條件下地塞米松和環(huán)磷酰胺對免疫功能影響的機制。

1材料和方法

實驗分組及動物處理昆明種雄性小鼠，日齡55～58天。60只分為5組：正常對照組；DEX組：腹腔注射地塞米松150μg/只，每日1次，連續(xù)注射3次；Cy組：腹腔注射環(huán)磷酰胺/只，每日1次，連續(xù)注射3次；VitC+DEX組：與DEX組同時注射；VitC+Cy組：與Cy同時注射；給藥第2天上述小鼠腹腔注射2%無菌淀粉1ml。

腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定于第4天取各組6只，小鼠腹腔注射5%雞紅細胞1ml，30min后，引頸處死小鼠，腹腔注射D-HanKs1ml，輕輕按揉腹壁1min，吸出腹腔液滴片。置37°C濕盒孵育30min后，用PBS沖洗，去除未貼壁M和游離雞紅細胞，1：1丙酮-甲醇固定7～8min，自然晾干。有姬母薩-瑞士染液進行染色，油鏡下計數(shù)M和M吞噬CRBC數(shù)。用下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的M/100個M×100%吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/100個M。

細胞涂片Giemsa染色各組小鼠第4天引頸處死，腹腔注射D-Hanks液5ml，吸出腹腔液4℃500r/min，去上清與PBS制成細胞懸液，調(diào)細胞為1×106個/ml，100μl涂片，涼干后甲醇固定，晾干Giemsa染色，普通光鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

腹腔巨噬細胞NO檢測NO2-/NO3-的測定按NO試劑盒說明書操作，最后測定500nm吸光度值。NO2-/NO-3=/。

2實驗結(jié)果

所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析法進行統(tǒng)計學(xué)分析，并采用Student-NK檢驗法進一步檢驗。腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定結(jié)果見表1。DEX和Cy注射組小鼠M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均明顯降低，與生理鹽水對照組比較具有高度統(tǒng)計學(xué)意義;VitC+DEX組M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)比DEX組有顯著提高；VitC+Cy組M的吞噬百分率和吞噬指數(shù)較Cy組差異無顯著性。形態(tài)學(xué)變化可見：DEX組和Cy組較對照組出現(xiàn)明顯形態(tài)變化細胞變小，染色質(zhì)凝聚，細胞質(zhì)濃縮，可見凋亡小體。

腹腔巨噬細胞NO檢測結(jié)果見圖1：小鼠腹腔灌洗液中NO濃度測定顯示：與對照組比，DEX組NO2-/NO-3濃度顯著上升，而VitC能部分逆轉(zhuǎn)NO濃度，但對Cy組無明顯改善。表1腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定結(jié)果

注：①與對照組比較，;②與對照組比較，;③與DEX組比較，；④與Cy組比較，

圖1腹腔巨噬細胞NO檢測結(jié)果注：①與對照組比較，P＜;②與DEX組比較，P＜，③與DEX組比較，P＜;④與Cy組比較，P＞

3討論

巨噬細胞是機體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細胞，本實驗選用腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的方法來觀察免疫抑制劑對巨噬細胞的影響。結(jié)果可見，免疫抑制劑可顯著抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力；VitC能明顯改善地塞米松對巨噬細胞的影響。文獻報道抗氧化劑VitC通過清除氧自由基和降低脂質(zhì)過氧化提高機體免疫功能［1～3］。機體氧化-抗氧化的平衡對維持正常的免疫功能具有重要的作用，它影響到免疫細胞膜磷脂、細胞內(nèi)蛋白、核酸的完整性和免疫信號的傳導(dǎo)及基因表達。免疫細胞由于其細胞膜磷脂含有較高的不飽和脂肪酸，因此對氧應(yīng)激非常敏感［4］。已有實驗證明VitC有很強的抗氧化作用，注射VitC可明顯減弱DEX對小鼠巨噬細胞吞噬功能的抑制作用，分析DEX對巨噬細胞的免疫抑制作用可能與其氧化損傷有關(guān)。文獻報道［5］抗氧化劑維生素C通過抑制DEX誘導(dǎo)的淋巴細胞凋亡增強淋巴細胞的增殖能力，VitC具有抗氧化作用，提示通過抗氧化促進細胞增殖，抑制DEX誘導(dǎo)的淋巴細胞的凋亡。巨噬細胞具有非特異性直接清除各種異物，殺傷病原體和腫瘤細胞的功能［6］。靜止的巨噬細胞胞體小，細胞活性低，吞噬功能弱。當(dāng)巨噬細胞被激活后，細胞胞體變大、表面突起增多，細胞內(nèi)有完整的細胞器，且溶酶體、線粒體增多，細胞吞噬功能增強。本實驗結(jié)果顯示，VitC改善巨噬細胞吞噬功能，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，VitC處理的M細胞表面突起增多，細胞伸展率提高并能對抗DEX引起的細胞變小，伸展性差，細胞聚集成團現(xiàn)象。有研究報道DEX可降低M的吞噬作用［7，8］，Grasso等［9］研究發(fā)現(xiàn)DEX與M體外共同孵育可抑制M細胞吞噬功能，但培養(yǎng)液中一旦去除DEX，M吞噬功能很快便得到恢復(fù)。DEX具有誘導(dǎo)免疫細胞凋亡的作用［10］。M凋亡的機制十分復(fù)雜，近年的研究發(fā)現(xiàn)許多因素與M凋亡有關(guān)。巨噬細胞受到刺激或進行吞噬作用后，發(fā)生呼吸暴發(fā)，可產(chǎn)生大量的活性氧及NO等活性物質(zhì)［11］。是巨噬細胞在腫瘤免疫中發(fā)揮獨特作用的基礎(chǔ)，一定濃度的NO又是M凋亡信息傳遞通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)控巨噬細胞自身凋亡保持巨噬細胞數(shù)量恒定［12］。有研究報道凋亡時活性氧和NO或減少或增多［13］，機制尚不清。本實驗結(jié)果提示DEX誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡與NO生成增多有關(guān)。NO是一種自由基氣體，其不成對電子在氮原子上，為氮自由基參與細胞內(nèi)和線粒體內(nèi)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，VitC為自由基鏈反應(yīng)阻斷劑，減輕損傷，能部分抑制巨噬細胞凋亡，細胞吞噬機能也獲得部分恢復(fù)，以DEX組較顯著。本實驗提示VitC以抗氧化與抑制DEX誘導(dǎo)的M凋亡有關(guān)。推測環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腹腔巨噬細胞凋亡是以直接損傷染色體而DEX以氧化損傷為主，VitC以抗氧化作用而減輕DEX誘導(dǎo)的M凋亡?！緟⒖嘉墨I】

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