淋巴細(xì)胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測(cè)

淋巴細(xì)胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測(cè)【摘要】目的：建立預(yù)處理淋巴細(xì)胞樣品后經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)淋巴細(xì)胞合成和釋放兒茶酚胺的方法，并為淋巴細(xì)胞合成和釋放CAs提供直接的證據(jù)。方法：淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清經(jīng)氧化鋁吸附，高氯酸洗脫；淋巴細(xì)胞經(jīng)破細(xì)胞，去蛋白，高氯酸提??；采用AtlantisC18反相色譜柱分離淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清以及細(xì)胞中的CAs，電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果：CAs分離效果良好，22min內(nèi)完成測(cè)定，各峰形對(duì)稱，雜質(zhì)峰少。用刀豆蛋白A誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中去甲腎上腺素含量最高，其次是多巴胺，腎上腺素最少；而ConA刺激的淋巴細(xì)胞內(nèi)多巴胺的含量最高，其次為去甲腎上腺素，腎上腺素最少。結(jié)論：對(duì)淋巴細(xì)胞樣品進(jìn)行預(yù)處理能提高HPLC檢測(cè)的靈敏度、減少干擾，這種方法可直接檢測(cè)到淋巴細(xì)胞合成和釋放CAs。

【關(guān)鍵詞】淋巴細(xì)胞；兒茶酚胺；高效液相色譜法

[Abstract]Objective:Toestablishanimprovedmethodinordertoeffectivelydeterminelevelsofcatecholamines(CAs)includingnorepinephrine(NE),epinephrine(E)anddopamine(DA)intheculturedlymphocytesandinthesupernatantsoftheculturesbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC).Methods:TheCAswereextractedfromlymphocytesbyultrasonicationandfromtheextracellularmediumbyaluminaabsorption.AtlantisC18columnwithelectrochemicaldetectiontowasusedsimultaneouslydetermineNE,EandDAinlymphocytesandtheextracellularmedium.Results:CAsincludingDA,NEandEintheconcanavalinA(ConA)-activatedlymphocytesandtheirsupernatantswereabletobedetermined.AmongthethreekindsofCAS,DAhadthehighestcontent(×10-19mol/L·cell),Ehadthelowestcontent(×10-19mol/L·cell),andNEhadintermediate(×10-19mol/L·cell).Inthesupernatants,NEcontentwasthehighest(×10-9mol/L),DAmedium(×10-9mol/L)andEthelowest(×10-9mol/L).Conclusion:TheimprovedHPLCmethodcaneffectivelydetectCAlevelsincludingNE,EandDAintheculturedlymphocytesandtheculturedsupernatants,anditshowsthatlymphocyteshavetheabilitytosynthesizeandsecreteCAs.

[Keywords]Lymphocyte;Catecholamines;Highperformanceliquidchromatography

機(jī)體內(nèi)兒茶酚胺包括去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞也能合成CAs，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[1，2，3]。但關(guān)于淋巴細(xì)胞合成和分泌CAs的直接證據(jù)目前仍未見(jiàn)報(bào)道。CAs的測(cè)定方法主要有三羥基吲哚法、乙二胺縮合法、放射酶學(xué)法、氣相色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法及稀土離子熒光探針?lè)ǖ?，但存在成本高、步驟繁瑣，靈敏度低等缺點(diǎn)。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展及日趨完善，高效液相色譜法以其靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)正逐漸取代其它檢測(cè)方法，成為臨床上檢測(cè)生物樣品中CAs含量最可靠的方法之一。然而，由于淋巴細(xì)胞合成和釋放的CAs極微量，本研究對(duì)淋巴細(xì)胞樣品進(jìn)行前期預(yù)處理，去除干擾因素，然后再采用HPLC經(jīng)AtlantisC18反相色譜柱分離，電化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)，能很好地優(yōu)化檢測(cè)條件，取得了滿意的分離檢測(cè)效果。

1材料與方法

淋巴細(xì)胞培養(yǎng)SD大鼠，體重200～250g，雌雄兼用，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠行頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下取腸系膜淋巴結(jié)，以RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌，碾碎，過(guò)濾，并以RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液離心洗滌3次。以完全培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重懸，混勻。滴于計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為×106個(gè)細(xì)胞/ml，每ml細(xì)胞懸液中加入刀豆蛋白A5μl，置于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48小時(shí)。

樣品預(yù)處理取培養(yǎng)48小時(shí)后的淋巴細(xì)胞懸液，離心，將細(xì)胞與培養(yǎng)液分離。取分離出的培養(yǎng)液上清，加入等體積的mol/L的Tris、50mg氧化鋁、適量的3,4-二羥基芐胺作為內(nèi)標(biāo)，輕搖15min，離心去上清，用超純水洗滌沉淀3遍，再加入mlmol/L的高氯酸，充分振蕩，離心200g×8min后取上清，用于HPLC測(cè)定。每毫升細(xì)胞沉淀中加入150μl的高氯酸，置于超聲波細(xì)胞粉碎儀上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，后加入150μl的N高氯酸，離心后取上清，其中加入適量的DHBA，用于HPLC測(cè)定。

儀器和試劑高效液相色譜儀，1525泵，2465電化學(xué)檢測(cè)器，717自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower工作站；AtlantisC18，×250mm柱，5μm色譜柱；玻璃碳工作電極，即位參比電極均為美國(guó)Waters公司生產(chǎn)。NE、E和DA均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，B8為天津試劑二廠進(jìn)口分裝，甲醇HPLC級(jí)，偏重亞硫酸鈉等其它試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純產(chǎn)品。

色譜條件標(biāo)準(zhǔn)品配置：分別稱取一定量的NE、E、DA，用溶解液溶解，配成濃度為1mg/100ml的儲(chǔ)備液，分裝后－80℃保存。儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋1000倍，配成10pg/μl的CAs標(biāo)準(zhǔn)品，并加適量的DHBA，限當(dāng)日使用;流動(dòng)相配置：NaH2PO450mmol/L，檸檬酸鈉50mmol/L，EDTA·2Na20mg/L，NaCl2mmol/L，B8mmol/L，用H3PO4調(diào)pH值，用μm膜過(guò)濾備用。儀器工作條件：流動(dòng)相流速為1ml/min，工作電壓為V，電極工作電壓為600V，電極工作室溫度為37℃。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都用x±s表示，采用Stata統(tǒng)計(jì)軟件中Student’st檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，以示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

色譜圖按照NE、E、DHBA、DA順序出峰，22min內(nèi)完成測(cè)定。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NE、E、DHBA、DA的保留時(shí)間分別為min、min、min、min；淋巴細(xì)胞裂解液中NE、E、DHBA、DA的保留時(shí)間分別為min、min、min、min。各組出峰時(shí)間因受流動(dòng)相流速、柱溫、流動(dòng)相的離子強(qiáng)度等的影響而略有差異。圖1、2中可見(jiàn)各峰形對(duì)稱，分離效果良好。

線性范圍與最低檢測(cè)限在本色譜條件下,NE、E、DA樣品量20～2000pg之間與峰面積有良好線性關(guān)系。最低檢測(cè)限分別為:NEpg、Epg、DApg。

樣品測(cè)定結(jié)果用ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中CAs含量及用ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞裂解液中CAs含量見(jiàn)圖3、4。

3討論

CAs作為神經(jīng)遞質(zhì)和激素與人們的健康和疾病有密切關(guān)系[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，CAs主要由神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞合成和釋放，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞也能合成和釋放CAs，并通過(guò)自分泌和旁分泌途徑作用于自身，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2~5]。我們以往的研究證明淋巴細(xì)胞內(nèi)存在合成CAs的酶TH[2，3]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，ConA刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NE含量最高，其次是DA，E含量最少；而ConA刺激的淋巴細(xì)胞內(nèi)DA的含量最高，其次為NE，E最少。

目前臨床上建立的高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法主要是檢測(cè)血中和尿中CAs的含量，而高效液相色譜法又包括電化學(xué)檢測(cè)、紫外檢測(cè)和熒光檢測(cè)法等，其中高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法靈敏度最高，方法簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好。以往我們檢測(cè)之前對(duì)樣品不做特殊處理并使用外標(biāo)法進(jìn)行分析[2，3，7]，由于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清及細(xì)胞裂解液中包含許多復(fù)雜成分，所以結(jié)果雖能檢測(cè)到DA、NE、E，但DA、NE、E3種物質(zhì)檢測(cè)峰之間可見(jiàn)許多雜質(zhì)峰，只能靠與同等色譜條件下檢測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)品中3種檢測(cè)峰位置的對(duì)比來(lái)確定DA、NE、E的位置。因此我們選用內(nèi)標(biāo)法分析，并對(duì)樣品進(jìn)行濃縮和純化[5,6,8]。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清先經(jīng)氧化鋁吸附CAs、以去除培養(yǎng)液中的復(fù)雜成分，然后用高氯酸洗脫CAs，以便上樣檢測(cè)；細(xì)胞中加入低滲的高氯酸進(jìn)行裂解，再用高濃度的高氯酸去除蛋白，得到純化的樣品。經(jīng)過(guò)這樣的處理，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清以及細(xì)胞裂解液中的CAs得到了濃縮和純化，去除了雜質(zhì)峰。同時(shí)，我們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)品和樣品中添加DHBA作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)DHBA檢測(cè)峰的位置，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品，使DA、NE、E檢測(cè)峰的位置一目了然，以便于結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。

本研究一方面為淋巴細(xì)胞合成和釋放CAs提供了直接的證據(jù)，另一方面通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，使測(cè)定CAs的高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法更穩(wěn)定、干擾更少，方法更準(zhǔn)確、可靠。樣品預(yù)處理方法比較簡(jiǎn)單、快速，能滿足細(xì)胞樣品中低含量或微量CAs的檢測(cè)，適用于臨床診斷和科研工作中生物樣品微量CAs的測(cè)定。

【參考文獻(xiàn)】

[1]QiuYH,ChengC,DaiL,etal.Effectofendogenouscatecholaminesinlymphocytesonlymphocytefunction[J].JNeuroimmunol,2005,167(1):45-47.

QiuYH,PengYP,JiangJM,etal.Expressionoftyrosinehydroxylaseinlymphocytesandeffectofendogenouscatecholaminesonlymphocytefunction[J].Neuroimmunomodulation,2004,11(1):75-76.

JiangJL,QiuYH,PengYP,etal.Immunoregulatoryroleofendogenouscatecholaminessynthesizedbyimmunecells[J].ActaPhysiologicaSinica,2006,58(4):309-310.

CosentinoM,MarinoF,BombefliR,etal.Endogenouscatecholaminesynthesis,metabolism,storageanduptakeinhumanneutrophils[J].LifeSciences,1999,64(11):975-976.

邱一華，彭聿平，王建軍.兒茶酚胺調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞和分子機(jī)制[J].生理學(xué)進(jìn)展，2003，34(4):303-305.

CosentinoM,BombelliR,FerrariM,etal.HPLC-EDmeasurementofendogenouscatecholaminesinhumanimmunecellsandhematopoieticcelllines[J].LifeSciences,2000,68:283-285.

彭聿平,邱一華,