樣本前期處理及染色趙恒

取材注意事項

1、植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死后迅速取出所需要的組織

2、取材必須新鮮，這一點對于從事細胞生物學研究尤為重要，應該盡可能割取生活著的組織塊，并投入固定液

3、切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷

4、切取的材料應該小而薄，便于固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2

1當前第1頁\共有26頁\編于星期五\2點固定液的性質和條件1、能迅速滲入組織，使組織細胞形態(tài)在短期內不至于有較大變化2、固定液有相當?shù)臐B透力，對組織各部分的滲透力相等，可使組織內外完全固定3、使組織細胞不至于因固定而引起人為的改變4、盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮5、使組織達到一定硬度，獲得較佳的折光率和對染料具有較強的親合力。固定當前第2頁\共有26頁\編于星期五\2點固定劑種類單純固定劑：10%甲醛、4%多聚甲醛、飽和的苦味酸溶液、冰醋酸、鋨酸混合固定劑：Bouin氏固定液、Zenker液（PH2.3）、Carnoy液、改良Bouin氏固定液當前第3頁\共有26頁\編于星期五\2點固定的目的1、防止組織溶解及腐敗，以保持組織和細胞與正常生活時的形態(tài)相似2、使細胞內蛋白質、脂肪、糖、酶等各種成分轉變?yōu)椴蝗苄晕镔|，以保持它原有的結構與生活時的相仿3、組織細胞內的不同物質經固定后可以產生不同的折光率，對染料也產生不同的親和力，造成光學上的差異，使得在生活情況下原來看不清楚的結構變得清晰起來，并使得細胞各部分容易著色，有利于區(qū)別不同的組織成分4、固定劑的硬化作用，增加組織硬度，便于制片

當前第4頁\共有26頁\編于星期五\2點固定時應注意的事項1、固定液及被固定的組織必須新鮮；固定液的用量一般為組織體積的10~20倍2、固定時間視組織塊的種類、性質、大小，固定液的種類性質、滲透力的強弱，固定時的溫度的高低，實驗目的等來決定3、防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形4、固定所用的固定液，以新配的為好，放置過久會失效5、在固定期間搖動組織或搖動容器有利于固定液的滲入，對長期固定的標本，可經常更換固定液6、固定時間太短，就會影響組織固定的效果時間太長，福爾馬林會產生一種酸，影響核的染色當前第5頁\共有26頁\編于星期五\2點脫水透明標本經二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。

步驟流水沖洗4h→70％乙醇2h→80％乙醇過夜→

90％乙醇2h→無水乙醇Ⅰ1h→無水乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min當前第6頁\共有26頁\編于星期五\2點較常用的透明劑是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等1、二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬2、甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆3、苯的用法同于二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。4、氯仿適于大塊組織的透明

當前第7頁\共有26頁\編于星期五\2點注意事項1、透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在5min至15min，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過1h為宜2、材料經過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好3、使用二甲苯透明時，應避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分并保持其無水狀態(tài)當前第8頁\共有26頁\編于星期五\2點浸蠟包埋1、組織經過脫水透明處理后浸蠟4h，然后進行包埋2、浸蠟須在恒溫箱中進行，恒溫箱的溫度調節(jié)至高于石蠟熔點3度當前第9頁\共有26頁\編于星期五\2點切片可能產生的問題及解決方法切片厚薄不勻原因：1、切片機有毛病2、夾刀不當，刀的傾角太大3、未旋緊標本臺螺旋4、石蠟塊過硬解決辦法1．矯正切片機裝置2．對癥治療3．旋緊螺旋4．將石蠟塊在水中浸泡

當前第10頁\共有26頁\編于星期五\2點材料發(fā)生裂隙破碎或脫落原因：1、脫水不干凈2、有透明劑殘留3、石蠟透入時，溫度過高或時間過長4、由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆5、材料太硬或太粗補救辦法：1、無法彌補2、增加浸蠟時間，重新包埋3、無法補救4、用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進行脫水和透明5、在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液

當前第11頁\共有26頁\編于星期五\2點展片和撈片1、直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待完全展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時擺正切片。

2、溫水漂浮法：用恒溫水浴箱，先使水溫保持在42℃，使切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會自然平整地展開，必要時可用眼科鑷輕輕拔開，然后撈片，并及時編號。展好的切片放在64℃恒溫烤箱中4h，烤干備用。當前第12頁\共有26頁\編于星期五\2點包埋模具染色缸當前第13頁\共有26頁\編于星期五\2點

切片盒切片機當前第14頁\共有26頁\編于星期五\2點HE

蘇木精—伊紅染色法簡稱HE染色法，石蠟切片技術里常用的染色法之一。S蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術方法。當前第15頁\共有26頁\編于星期五\2點染色步驟1、64℃烤片30min2、脫蠟至水（二甲苯ⅠⅡ各15min，無水乙醇ⅠⅡ各5min，90％、80％、70％乙醇各1min）3、蒸餾水浸洗3min4、蘇木素染3min5、鹽酸酒精分化6、自來水返藍15min7、伊紅染色30min8、脫水（70％、80％、90％乙醇各30s，無水乙醇ⅠⅡ各2min，二甲苯ⅠⅡ各15min）9、封片鏡檢當前第16頁\共有26頁\編于星期五\2點當前第17頁\共有26頁\編于星期五\2點當前第18頁\共有26頁\編于星期五\2點幾種常見的染色問題脫蠟：切片中白色的區(qū)域脫蠟不徹底，染色液由于石蠟斑點的殘留而不能滲透著色。原因：①烤(烘)片溫度太低，脫蠟前沒有充分烤(烘)干。②二甲苯脫蠟時間不足，或二甲苯使用過久，造成脫蠟不盡。對策：切片需退回到脫蠟步驟，延長脫蠟時間，或跟換二甲苯，重新染色。當前第19頁\共有26頁\編于星期五\2點染色：蘇木素著色原因：染色時間短；蘇木素過度氧化，失去染色能力；分化時間過長。蘇木素染色太淺，細胞核與細胞質顏色對比度差。對策：切片重新染色。當前第20頁\共有26頁\編于星期五\2點細胞核過染，核膜、核仁等不清晰，細胞質(尤其是皮膚上皮細胞)含有大量的細胞核染色液蘇木精，導致細胞核與細胞質比例失調。原因：與圖2相反，染色液時間過長、切片太厚、分化步驟時間太短。對策：如果切片不是因為太厚，脫色、漂白、重新染色，對于染色和分化時間做些適當?shù)恼{整。若太厚則需要重新切片。當前第21頁\共有26頁\編于星期五\2點切片細胞核棕色，表明蘇木精沒有充分藍化，或蘇木精過度氧化失去染色能力原因：蘇木精染色液過度氧化和切片在蘇木精染液染色后返藍不足。對策：染色前檢查蘇木精染色液的染色能力，過渡氧化，應及時更換。其次，在蘇木精染色后，給切片以足夠的藍化時間。當前第22頁\共有26頁\編于星期五\2點染色后有雜質原因：蘇木精染色液中的金屬膜，黏附在玻片上。對策：每天染色前仔細過濾蘇木精染色液，或建議使用半氧化蘇木精染色液。當前第23頁\共有26頁\編于星期五\2點伊紅著色切片中央?yún)^(qū)域伊紅染色不均勻，可能為弱堿性溶液殘留導致伊紅拒染所致原因：伊紅染液的pH值可能大于5；也可能是藍化液殘留過多；切片太?。换蚯衅浺良t染色后在乙醇脫水時間過長。對策：檢查伊紅染液的pH值，用乙酸將其調節(jié)在4.6-5.0之間，使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍化后，用自來水沖干凈。檢查切片的厚度。脫水時不要讓切片在低濃度乙醇停留時間過長，因為含水多的低濃度乙醇會將伊紅的顏色分化掉。當前第24頁\共有26頁\編于星期五\2點原因：伊紅染色液濃度太高；切片在伊紅染色時間過長；切片在伊紅染色后經乙醇脫水步驟時過的太快，而使乙醇分化伊紅的作用不能產生。對策：適當稀釋伊紅染色液，減少伊紅染色時間，或者使切片在乙醇脫水等步驟時，停留時間相對均勻。同樣，也要檢查切片的厚度是否合適。伊紅深染導致細胞核與細胞質沒有層次，缺乏對比當前第25頁\共有