基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)

基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)第一頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第二章基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)

第二頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基因工程的理論基礎(chǔ)第三頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日（一）原核生物的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.操縱子結(jié)構(gòu)

操縱子（Operon），由幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇排列而組成的一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位（coordinatedunite），稱為操縱子。

一基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因結(jié)構(gòu)基因第四頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日大腸桿菌乳糖操縱子

第五頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日色氨酸操縱子

第六頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第七頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日2.原核細(xì)胞mRNA的特征（1）半衰期短（2）多順?lè)醋有问?/p>

（3）存在SD序列

原核生物中起始密碼子AUG上游7～12個(gè)核苷酸序列因其與16SrRNA3’末端反向互補(bǔ)而被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過(guò)程中起作用。

（4）起始密碼子常為AUG（有時(shí)GUG，甚至UUG）。第八頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3.原核細(xì)胞基因的終止子根據(jù)對(duì)細(xì)菌和噬菌體DNA模板上的終止信號(hào)的分析，發(fā)現(xiàn)它們具有共同的結(jié)構(gòu)特征：①終止點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；②在終止點(diǎn)前面有一段由4～8個(gè)A組成的序列，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U。

UUUUUUUUUUUURNA第九頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日（二）真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.真核生物基因的不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）

第十頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日內(nèi)含子是一個(gè)基因中非編碼DNA片段，它分開(kāi)相鄰的外顯子。

外顯子是一個(gè)基因中編碼蛋白序列。嚴(yán)格地說(shuō),外顯子是指保留在初級(jí)mRNA中不被剪切掉的區(qū)域,包括5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、編碼序列和3’非翻譯區(qū)(3’UTR)。

外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)是指外顯子和內(nèi)含子的交界，又稱邊界序列。GT-AG法則

序列分析表明，幾乎每個(gè)內(nèi)含子5’端起始的兩個(gè)堿基都是GT，3’端最后兩個(gè)堿基總是AG，由于這兩個(gè)堿基的高度保守性和存在的廣泛性，有人把它稱為GT-AG法則，即：5’GT…AG3’。

第十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日衛(wèi)星DNA真核生物基因組中高度重復(fù)的DNA,有一些20～30bp的極短序列，且以數(shù)千個(gè)拷貝的串連方式排列，這種序列稱為衛(wèi)星DNA。2.衛(wèi)星DNA在染色體DNA片段的氯化銫密度梯度離心中，由于浮力密度的不同，這種重復(fù)序列在主帶DNA附近出現(xiàn)的衛(wèi)星帶，因此稱之為衛(wèi)星DNA。第十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3.真核生物mRNA的特征（1）5’端的帽子結(jié)構(gòu)

幾乎全部的真核mRNA端都具“帽子”結(jié)構(gòu)。雖然真核生物的mRNA的轉(zhuǎn)錄以嘌呤核苷酸三磷酸（pppAG或pppG）領(lǐng)頭，但在5’端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥(niǎo)核苷三磷酸（m7GpppAGpNp）。mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。

第十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日(1)有助于mRNA越過(guò)核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；(2)保護(hù)5′不被核酶降解；(3)翻譯時(shí)供IFⅢ（起始因子）和核糖體識(shí)別，是翻譯所必需的。第十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日（2）3’末端Poly（A）尾巴除了組蛋白以外，真核生物mRNA3’末端都有由40~200個(gè)A組成的Poly（A）尾巴。Poly(A)尾不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后的前體mRNA以ATP為前體，由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3’末端。

第十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用：A、用Poly（T）作為合成cDNA第一鏈的引物。B、用Poly（T）純化柱從總RNA中分離mRNA寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式；它大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，其多聚(A)尾巴一般比較長(zhǎng)，隨著mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逗留時(shí)間延長(zhǎng)，多聚(A)逐漸變短消失，mRNA進(jìn)入降解過(guò)程。它可促進(jìn)核糖體的有效循環(huán)。Poly（A）尾巴有三個(gè)方面的功能：第十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日寡聚（dT）-纖維素柱層析法常規(guī)方法RNA(高鹽緩沖液)寡聚（dT）纖維素柱低鹽溶液和蒸餾水洗脫較高純度的mRNA加樣結(jié)合第十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日DynabeadsOligo(dT)25是一種直徑為2.8μm的均一的、超順磁的微球體，其表面的5’連接鍵共價(jià)結(jié)合了由25個(gè)脫氧核糖核苷組成的長(zhǎng)鏈。

mRNA磁珠分離法

第十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日二從DNA到蛋白質(zhì)（一）中心法則1970年特明(H.M.

Temin)以在勞斯肉瘤病毒內(nèi)發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶這一成就進(jìn)一步發(fā)展和完善了“中心法則”。第二十頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日（二）基因表達(dá)從DNA到蛋白質(zhì)的過(guò)程稱為基因表達(dá)。

DNARNA轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白質(zhì)第二十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日原核生物和真核生物比較1.啟動(dòng)子第二十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日2.RNA聚合酶原核生物真核生物RNA聚合酶僅一種RNA聚合酶有三種RNA聚合酶Ⅰ大部分rRNARNA聚合酶ⅡmRNA和snRNARNA聚合酶ⅢtRNA和5sRNA全酶的組成是α2ββ'σ

第二十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3.表達(dá)過(guò)程原核生物真核生物無(wú)細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時(shí)進(jìn)行，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。有細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中，翻譯在細(xì)胞質(zhì)中，并且轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有加工過(guò)程，基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同水平。第二十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日4.表達(dá)的調(diào)控（1）真核生物的表達(dá)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)分子受體分子離子通道第二信使分子蛋白激酶或磷酸酯酶活性轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)第二十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日（2）原核生物的表達(dá)調(diào)控①代謝物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié)

第二十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來(lái)關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化?？勺瓒粽{(diào)節(jié)中的基因平時(shí)都是開(kāi)啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)和酶的工作過(guò)程中，但由于一些特殊代謝物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達(dá)，所以稱為可阻遏基因。第二十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日②弱化因子對(duì)基因活性的影響

第二十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日③降解物對(duì)基因活性的調(diào)節(jié)

添加葡萄糖能量得到滿足細(xì)菌的腺苷酸環(huán)化酶抑制環(huán)腺苷酸(cMAP)↓cAMP＋受體蛋白↓調(diào)控的基因就不表達(dá)第二十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日④細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

氨基酸饑餓

空載tRNA

鳥(niǎo)苷四磷酸（ppGpp）鳥(niǎo)苷五磷酸（pppGpp）

關(guān)閉一些基因的表達(dá)開(kāi)啟氨基酸合成基因的表達(dá)生產(chǎn)各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程均被停止

第三十頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日⑤環(huán)腺苷酸受體蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

葡萄糖缺乏cAMP合成↑c(diǎn)AMP受體蛋白促進(jìn)RNA聚合酶結(jié)合一些基因的啟動(dòng)子抑制RNA聚合酶結(jié)合一些基因的啟動(dòng)子第三十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日總結(jié)基因工程操作中應(yīng)注意的真核生物與原核生物的差異1.基因結(jié)構(gòu)的差異2.啟動(dòng)子和RNA聚合酶的差異3.蛋白質(zhì)的翻譯后修飾加工（前體切割、二硫鍵、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、軟脂化）4.基因表達(dá)的調(diào)節(jié)（表達(dá)量）5.載體的差異6.蛋白質(zhì)的純化方便第三十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日1．遺傳密碼與信息流

儲(chǔ)存在DNA上的遺傳信息通過(guò)mRNA傳遞給蛋白質(zhì)，mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系是通過(guò)遺傳密碼的破譯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這3個(gè)核苷酸就稱為密碼子，也叫三聯(lián)子密碼。蛋白質(zhì)是通過(guò)遺傳信息流由基因控制的。三基因研究進(jìn)展第三十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日2．結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因

結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)是可以轉(zhuǎn)錄成為各種RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)然后翻譯成多肽鏈，最終形成各種功能蛋白質(zhì)和酶。

從廣義上講，任何一種能夠調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因都可叫做調(diào)節(jié)基因(regulatorygene)，一般情況下則是指基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)別的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后由mRNA翻譯成阻遏蛋白質(zhì)或激活蛋白質(zhì)，通常也稱為轉(zhuǎn)錄因子或反式作用因子。它們通常結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的非編碼區(qū)的順式元件上起調(diào)控作用。第三十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3．管家基因和奢侈基因

具有相同遺傳信息的個(gè)體細(xì)胞間其所利用的基因并不相同，有的基因活動(dòng)是維持細(xì)胞基本代謝所必需的，而有的基因則在一些分化細(xì)胞或受到外界刺激的細(xì)胞中活動(dòng)。前者稱為管家基因(house-keepinggene)，如編碼核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被稱為奢侈基因(1uxurygene)，第三十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日4．移動(dòng)基因

1967年在大腸埃細(xì)菌的乳糖操作子的研究中第一次發(fā)現(xiàn)了稱為插入序列(insertionsequence，IS)的轉(zhuǎn)座因子。直至1980年夏皮羅(Shapiro)等人證實(shí)了可移位的遺傳基因存在，說(shuō)明某些基因具有移動(dòng)性。轉(zhuǎn)座子也稱易位子，是由兩個(gè)重復(fù)順序夾著一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成。有的轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列就是IS。轉(zhuǎn)座子也和IS一樣，能從一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位點(diǎn)，或從一個(gè)復(fù)制子轉(zhuǎn)座到另一個(gè)復(fù)制子。轉(zhuǎn)座子屬于可移動(dòng)的遺傳因子—移動(dòng)基因。除了轉(zhuǎn)座因子外，病毒和質(zhì)粒都是染色體外的可以移動(dòng)的遺傳物質(zhì)，都必須依賴宿主而復(fù)制。第三十六頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日5．重疊基因

核苷酸序列是彼此重疊的兩個(gè)基因稱為重疊基因(overlappinggenes)或鑲嵌基因(nestedgenes)。第三十七頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第三十八頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日6．假基因

假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達(dá)或表達(dá)異常，生成無(wú)生物活性的多肽。假基因DNA順序可在相應(yīng)基因名稱之前加φ表示，如α珠蛋白基因家族中φξ1與功能性ξ2基因同源，φξ1有3個(gè)堿基被取代，其中密碼子6的GAG—TAG(谷氨酸→終止密碼)發(fā)生無(wú)義突變。第三十九頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日例如，在珠蛋白、免疫球蛋白、組織相容性抗原(histocompatibi1ityantigen)以及肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等基因家族(genefamily)中，都存在著這樣的功能失活的假基因。

第四十頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日(1)重復(fù)的假基因

許多假基因都是同“親本基因”(Parental8ene)連鎖的，而且同其編碼區(qū)及側(cè)翼序列的DNA具有很高的同源佳。可見(jiàn)產(chǎn)生此種類型的假基因拷貝的一種可能的機(jī)理是，由含有“親本基因”的染色體區(qū)段串聯(lián)重復(fù)形成，故稱之為重復(fù)的假基因。珠蛋白基因家族中的假基因即屬于這一種類型。第四十一頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第四十二頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

(2)加工的假基因

除了重復(fù)的假基因外．在真核生物的染色體基因組中還存在著一類加工的假基因(processedpseudogene)。這類假基因沒(méi)有與“親本基因”連鎖，而且其結(jié)構(gòu)是同轉(zhuǎn)錄本而非“親本基因”類似。例如，它們都沒(méi)有啟動(dòng)子和間隔子，但在基因的3’—末端則都有一段延伸的腺嘌呤短序列，恰似mRNA分子3’—末端的poly(A)尾巴。這些特征表明，此類假基因很可能是來(lái)自加工的RNA之DNA拷貝，因此稱之為加工的假基因。

第四十三頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第四十四頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日7．串聯(lián)基因簇

中度重復(fù)DNA有許多類型的重復(fù)序列組成。多重復(fù)序列組成的基因簇在重復(fù)區(qū)域的下游出現(xiàn)，這些通常是其產(chǎn)物需求量很高的基因，rDNA(編碼rRNA)就是其中一例。編碼18S、5.8S和28SrRNA的45S前體的基因就有約10～10000個(gè)拷貝的重復(fù)序列，其拷貝數(shù)因物種而異。人類基因組中45S基因在5個(gè)不同的染色體上都有排列，每一排列包含約40個(gè)拷貝。在分裂間期這些區(qū)域都處于核仁區(qū)，核仁是細(xì)胞核中的致密區(qū)域，是rRNA合成和修飾的工廠。另一個(gè)串聯(lián)基因簇的例子是組蛋白基因，其產(chǎn)物在S期大量產(chǎn)生，5種組蛋白基因在一個(gè)基因簇，有的可直接重復(fù)達(dá)數(shù)百次。第四十五頁(yè)，共四十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日8．基因組

基因組(genome)是1924年提出的，是指一個(gè)生物體、細(xì)胞器或病毒的全部基因。原核生物基因組僅由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，它的基因組就是它的整個(gè)染色體。但對(duì)于二倍體的高等生物，能維持配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體構(gòu)成的一個(gè)基因組。對(duì)于植物細(xì)胞而言，則有3個(gè)基因組，即染色體基因組(核基因組)、線粒體基因組和葉綠體