淺論慢性低氧高二氧化碳對小鼠骨骼肌形態(tài)的影響

淺論慢性低氧高二氧化碳對小鼠骨骼肌形態(tài)的影響【摘要】目的:觀察慢性低氧高二氧化碳小鼠股外側(cè)肌顯微、超微結(jié)構(gòu)的變化，探討慢性低氧高二氧化碳對小鼠骨骼肌形態(tài)的影響。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組建立慢性低氧高二氧化碳小鼠動物模型。觀察兩組體重變化；光鏡觀察小鼠股外側(cè)肌細胞形態(tài)、炎性細胞、脂肪細胞等變化；透射電鏡觀察肌纖維走向、形態(tài)及線粒體損害等超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：與對照組比較，實驗組小鼠體重下降；肌纖維局部萎縮，肌纖維排列紊亂；炎性細胞浸潤，脂肪沉積增多；肌細胞線粒體增多伴內(nèi)部結(jié)構(gòu)明顯破壞。結(jié)論：慢性低氧高二氧化碳血癥可導(dǎo)致小鼠的肌纖維萎縮和線粒體損害，伴有炎性細胞浸潤。

【關(guān)鍵詞】低氧；高碳酸血癥；骨骼肌；顯微結(jié)構(gòu)；超微結(jié)構(gòu)；小鼠

Abstract:Objective:Toobservethechangesofpathologicmorphousandultrastuctureinthevastuslateralisofmiceexposedtochronichypoxia-hypercapnia.Methods:C57BL/6micewereassignedrandomlyintocontrolgroupandexperimentgroup.Animalmodelofchronichypoxia-hypercapniawasbuiltinexperimentgroup.Musclecellsandinflammatorycellswereobservedbylightmicroscopy.Theultrastureofmusclecellandmuscle’smitochondriawereobservedbyelectronmicroscope.Results:Comparedwiththatincontrolgroup，weighlossesofmicewerepresentedinexperimentgroup.Inexperimentgroup，musclesatrophyandderangement，inflammatorycellsinfiltrationandincrementoffattydepositionwereobserved.Thenumberofmitochondriawasincreasedandtheirinternalstructuresweredestroyedinexperimentgroup.Conclusion:Miceexposuretohypoxia-hypercapniacaninducetheirmusclesatrophy，muscles’mitochondriadestroyandinflammatorycellsinfiltration.

Keywords:hypoxia；hypercapnia；skeletalmuscle；microstructure；ultrastructure；mice

慢性阻塞性肺疾病是以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部疾病，但越來越多的研究表明，COPD的病變還累及多個肺外器官。骨骼肌功能障礙是其較為突出的肺外病變之一，它嚴重影響COPD患者運動能力和生活質(zhì)量。其發(fā)病機制仍不清楚，估計病因主要集中在肌纖維的再分布和能量代謝酶活性改變等方面[1]。本實驗?zāi)MCOPD發(fā)病機制，觀察在常壓慢性低氧高二氧化碳條件下，小鼠股外側(cè)肌顯微、超微結(jié)構(gòu)變化，旨在探討低氧高二氧化碳對骨骼肌形態(tài)學(xué)改變的影響。

1材料和方法

動物與分組SPF級C57BL/6雄性小鼠，體重20～28g，6～8周齡，按隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組8只。

試劑與儀器TECNAI10透射電子纖維鏡，超薄切片機，戊二醛，四氧化鋨，EPON812(分析純，日本)，蘇木素，伊紅，其余為國產(chǎn)分析純。

低氧高二氧化碳小鼠模型的建立參照陳鳴和等建立的方法。

骨骼肌標本取材兩組動物成模后，稱體重，予1%水合氯醛腹腔麻醉后處死，取小鼠右側(cè)股外側(cè)肌2份，1份行常規(guī)HE染色，1份電鏡超薄切片。

光鏡切片的制備和觀察組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，8μm切片。切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素染色2min，以1%鹽酸酒精分化30s，流水沖洗返藍25min，%伊紅染色5min，行常規(guī)脫水、封片。在HPLAS1000彩色圖像處理系統(tǒng)下對骨骼肌炎癥細胞浸潤、骨骼肌纖維斷裂、壞死、脂肪沉積、肌膜核內(nèi)移等進行觀察。

電鏡超薄切片的制備和觀察將骨骼肌標本用鋒利刀片修成1mm3組織方塊，以%戊二醛電鏡專用固定液固定2h，PBS緩沖液沖洗1次，1%鋨酸后固定60min，行常規(guī)脫水、浸透、包埋、超薄切片、鉛鈾染色。TECNAI10透射電鏡下觀察取得圖像，也在圖像分析系統(tǒng)下對骨骼肌肌纖維排列、肌纖維萎縮、纖維溶解和線粒體等進行觀察。

以上光鏡和電鏡下觀察操作均由同一位病理醫(yī)生在不知道實驗分組的情況下進行，參照Cross方法評分以0為無明顯損害，+為輕微的損害，++為中度損害，+++為重度損害為標準進行評判，每張圖像均重復(fù)觀察2次保證實驗可重復(fù)性和病理診斷的正確性。

統(tǒng)計學(xué)處理方法計量數(shù)據(jù)用t檢驗，半定量數(shù)據(jù)用卡方檢驗，兩次觀察結(jié)果用Kappa分析其結(jié)果的一致性。

2結(jié)果

對照組與實驗組小鼠體重變化比較對照組小鼠體重造模前后體重變化為g，實驗組小鼠體重造模前后體重變化為g，差異有極顯著性。

骨骼肌顯微結(jié)構(gòu)觀察光鏡下可見對照組小鼠骨骼肌肌纖維形態(tài)正常，實驗組小鼠骨骼肌纖維局部萎縮，肌纖維間炎性細胞浸潤增多，輕微脂肪沉積，未發(fā)現(xiàn)明顯肌纖維斷裂、壞死，肌膜核內(nèi)移。肌肉顯微病理嚴重程度評分情況見表1。

骨骼肌超微結(jié)構(gòu)觀察透射電鏡下可見對照組骨骼肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常，肌絲排列有序，線粒體結(jié)構(gòu)正常。實驗組小鼠肌纖維局部明顯萎縮變細，肌原纖維走行紊亂，Z線漂移，線粒體濃聚，但線粒體腫脹，排列紊亂，膜部分消失，嵴不規(guī)則斷裂。肌肉超微病理嚴重程度評分情況見表2。

3討論

骨骼肌功能障礙作為COPD主要的肺外病變之一，和患者病死率等預(yù)后因素密切相關(guān)。COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制仍未完全清楚，目前為數(shù)不多的研究主要集中在臨床研究。由于有眾多的因素能影響COPD患者骨骼肌功能，比如：有否吸煙，戒煙時間長短，低氧高二氧化碳嚴重程度，發(fā)病前患者肌肉情況、營養(yǎng)情況，發(fā)病后伴發(fā)的疾病情況，治療時有否使用糖皮質(zhì)激素等，臨床研究中對照組的選擇標準等錯綜復(fù)雜，難以統(tǒng)一，所以不同研究者得出不同的甚至相反的研究結(jié)果，可能與此有關(guān)。因此有必要進行容易控制對照因素的基礎(chǔ)動物研究。

本研究結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組小鼠體重下降，顯微、超微鏡下局部肌纖維萎縮，可以初步得出低氧高二氧化碳能造成小鼠骨骼肌萎縮，至少是局部肌萎縮的結(jié)論，而且肌纖維間脂肪細胞的沉積也間接地證明了這點。這與臨床的研究結(jié)果是相符合的。慢性低氧高二氧化碳條件下骨骼肌的萎縮雖然在一定范圍內(nèi)能起到適應(yīng)性的作用：減少局部氧耗，使肌肉纖維間毛細血管密度相對增加，縮小氧彌散距離等，但骨骼肌的萎縮勢必影響骨骼肌的容積，進而導(dǎo)致骨骼肌肌力下降。

同時本研究也顯示實驗組小鼠股外側(cè)肌肌纖維間炎性細胞浸潤增多，提示COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機制和炎癥有密切關(guān)系。目前的臨床研究也有報道稱在COPD患者血液及骨骼肌本身均可以發(fā)現(xiàn)炎癥遞質(zhì)和炎性細胞增多，并認為這些增多的炎癥物質(zhì)能通過影響骨骼肌蛋白的降解、合成或通過直接影響骨骼肌收縮導(dǎo)致骨骼肌功能障礙。本研究還觀察到實驗組小鼠骨骼肌線粒體濃聚、腫脹、排列紊亂，線粒體膜部分消失，嵴斷裂。線粒體內(nèi)集中了體內(nèi)絕大部分與氧化代謝有關(guān)的酶，是機體的主要產(chǎn)能器官。肌肉有兩種線粒體：①位于肌纖維之間的線粒體，②位于肌膜下的線粒體。其中肌纖維間線粒體占體內(nèi)75%以上，肌肉收縮能量主要來源于此。本研究中線粒體濃聚現(xiàn)象可能是慢性低氧高二氧化碳下機體的一種適應(yīng)性改變，但由于線粒體出現(xiàn)腫脹、排列紊亂、線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞等改變，從而使線粒體產(chǎn)生能量的能力下降，肌肉的氧化代謝能力下降，進而使骨骼肌耐力下降。這也許可以解釋某些骨骼肌萎縮不明顯的COPD患者出現(xiàn)骨骼肌功能障礙的原因。

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